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O transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) é caracterizado por uma deficiência na capacidade de neutralizar as respostas de medo a sinais associados ao trauma.Estudos em humanos e animais apontam diferenças no envolvimento de certas áreas do córtex frontal como mediadores-chave que determinam o sucesso da supressão do medo, mas a interação dos circuitos neurais que determinam o envolvimento diferencial dessas áreas não é clara.Para entender melhor como as diferenças individuais na recordação da extinção são refletidas nas diferenças na atividade do circuito neuronal, rotulamos as projeções do córtex sublímbico (IL) do rato com marcadores retrógrados e comparamos as projeções neuronais dentro e fora dos neurônios de projeção do IL.Analisamos esses dados, agrupando-os de acordo com o grau de preservação da memória fading em ratos.Descobrimos que nas células que projetam IL, os neurônios no paratálamo posterior exibiram atividade aumentada em ratos, que exibiram boa memória de extinção.Além das células que projetam IL, o aumento da atividade de Fos foi observado em áreas selecionadas do claustro de ratos e do hipocampo ventral com boa resolução.Nossos resultados indicam que as diferenças na recordação da extinção estão associadas a padrões específicos de atividade neural dentro e fora das projeções de IL.
O condicionamento do medo ocorre quando um estímulo neutro é associado a um estímulo incondicionado aversivo (UCS), de modo que o estímulo originalmente neutro, agora o estímulo condicionado (CS), provoca uma resposta de medo condicionada (CR) na ausência do UCS.A reversão do medo condicionado foi impulsionada por uma diminuição em CR para CS devido à apresentação repetida de CS na ausência de UCS1.Pesquisas anteriores mostraram que o transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) está associado à incapacidade de lembrar a extinção das respostas de medo condicionadas2.A pedra angular da terapia cognitivo-comportamental para o tratamento do transtorno de estresse pós-traumático é a terapia de exposição baseada na extinção das respostas de medo aprendidas3,4.Portanto, estudos de diferenças individuais no medo de extinção de roedores e mecanismos neurais subjacentes podem ajudar a elucidar as diferenças nas respostas humanas ao trauma e ao tratamento do transtorno de estresse pós-traumático.Apesar do progresso na identificação dos mecanismos neurais que distinguem as memórias de extinção bem-sucedidas das malsucedidas, ainda há muito a ser descoberto.
Modelos de roedores são úteis neste trabalho porque existem diferenças individuais significativas na lembrança da extinção de roedores7,8,9,10.Trabalhos anteriores investigando os mecanismos neurais da extinção do medo em nível populacional mostraram que a ativação do córtex infralíbico (IL) é necessária para a recuperação da extinção (refs 11, 12, 13, mas veja 14), e alguns estudos encontraram uma diminuição na atividade de roedores em IL exibindo memória pobre sobre a extinção em comparação com roedores, que são bem temidos.No entanto, os mecanismos pelos quais os LIs estão diferencialmente envolvidos na facilitação da eliminação do medo em roedores em comparação com aqueles que mostram extinção mais fraca não são claros.
Uma possibilidade é que as diferenças na memória de extinção do medo entre os indivíduos sejam o resultado da ativação diferencial de LIs aferentes específicos.Estudos anatômicos18 mostraram que várias áreas corticais e subcorticais do cérebro enviam projeções densas para IL, que por sua vez envia projeções eferentes para muitas áreas do cérebro.Estudos em nível populacional mostraram que as projeções de IL para a amígdala são importantes para adquirir a extinção do medo20,21,22 e a entrada de IL da amígdala basolateral (BLA) também está associada ao aprendizado da extinção.Há menos pesquisas sobre o envolvimento de circuitos centrados em IL na recordação de extinção, embora trabalhos recentes sugiram que tanto o hipocampo ventral quanto o dorsal estão envolvidos na previsão de IL.As projeções eferentes do LI para o núcleo recombinador do tálamo, aparentemente, também participam da memória da extinção do medo.
Esses estudos anteriores estão começando a pintar um quadro da interação dos circuitos neurais envolvidos na recordação da extinção, mas há muito poucos dados sobre se a atividade nos circuitos neurais centrados em IL influencia as diferenças individuais na recordação da extinção.Aqui, procuramos determinar se as diferenças na memória de extinção do medo entre os indivíduos estão associadas a alterações na ativação de entrada de IL em regiões específicas do cérebro.Em particular, avaliamos a ativação de células aferentes IL no núcleo paraventricular do tálamo (PVT), clavícula (CLA), BLA e hipocampo ventral (vHPC).Essas regiões do cérebro foram escolhidas tanto porque enviam projeções densas para IL quanto porque há motivos para suspeitar que possam estar envolvidas na expressão da extinção do medo 18 .Por exemplo, um estudo recente mostrou que PVT, uma região conhecida por estar envolvida na aquisição e reprodução do medo, é necessária para a reprodução da extinção.Além disso, estudos anteriores mostraram aumento da atividade da amígdala basal e vHPC em ratos expressando memória de extinção.Por último, a análise do claustro é mais exploratória dado que nenhum dos trabalhos anteriores avaliou o seu papel na extinção.No entanto, trabalhos recentes sugerem que ela desempenha um papel no condicionamento contextual do medo29.
Traçadores retrógrados conjugados com GFP viral foram injetados no IL de ratos antes do teste comportamental, e a atividade de Fos nos aferentes do IL foi medida durante o replay da extinção, recordação do medo e em ratos não submetidos ao teste comportamental.Nossos resultados indicam que projeções do tálamo paraventricular posterior para IL mostram aumento da atividade em ratos que lembram a extinção com sucesso.Além das previsões de IL, a atividade neural em certas áreas da clavícula e do hipocampo ventral foi aumentada em ratos que regrediram bem.Nossos resultados mostram que padrões de atividade neural intrínseca e extrínseca projetados em IL estão associados a diferenças individuais na memória de extinção do medo.
Cinquenta e quatro ratos Sprague-Dawley machos adultos (300-325 g na chegada) obtidos de Charles River Laboratories (Raleigh, NC) foram usados ​​como sujeitos.Os ratos foram alojados em pares, com livre acesso a ração e água, em um ciclo claro/escuro de 12 horas (luzes acesas às 7h).Dois grupos de ratos (n = 28 e n = 26) foram usados ​​para esses experimentos.Após a exclusão de morte, erro cirúrgico, falta de expressão de GFP no local alvo, má qualidade do tecido e problemas comportamentais (explicados em Métodos), o grupo de recordação da extinção incluiu 21 ratos e o grupo de recordação do medo incluiu 7 ratos, gaiolas.o grupo consistia em 7 ratos (35 ratos foram incluídos na análise final).Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Stony Brook University e estavam de acordo com as Diretrizes ARRIVE (https://arriveguidelines.org) e as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
Os ratos foram tratados dois dias antes da cirurgia.Os ratos foram anestesiados com cetamina (87 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), colocados em um aparelho estereotáxico (Stoelting, Woodale, IL) e receberam injeções unilaterais de AAVrg-CAG-GFP (Addgene, 30) em IL.(equilibrar as injeções esquerda e direita).Para a injeção, uma cânula de calibre 22 foi posicionada (AP: + 3,00, ML: ± 0,6, DV: – 5,2).Insira uma cânula interna 28G (conectada a uma bomba de infusão por meio de tubulação PE 20) na cânula guia para fornecer 0,6 µl de vírus a uma taxa de 0,15 µl por minuto e deixe no local por 5 minutos após a infusão estar intacta..Após a sutura, os ratos foram injetados com meloxicam (1 mg/kg) e, assim que conseguiram se movimentar, foram devolvidos às suas gaiolas.Os ratos foram mantidos em suas gaiolas por cerca de 7 semanas para permitir a recuperação do vírus e o transporte retrógrado.Três ratos morreram sob anestesia, resultando em 51 ratos (94%) recuperando-se com sucesso da cirurgia.
Todos os procedimentos foram realizados em câmaras de condicionamento de 32 cm × 25 cm × 21 cm (Clever Systems Inc., Reston, VA) alojadas em caixas de isolamento acústico de 45,7 cm × 43,2 cm × 43,2 cm (Clever Sys. . Inc.).).Durante as sessões de aprendizado e recordação da extinção, o contexto foi alterado para ser diferente do contexto condicional original.A condição A (geração de medo) incluiu lâmpadas incandescentes de 28 volts, lâmpadas domésticas (Chicago Micro Lighting, Reino Unido), enquanto a condição B (treinamento de extinção, teste de recuperação de extinção e teste de recuperação de medo) incluiu lâmpadas LED infravermelhas (Univivi IR Illuminator, Shenzhen) ., China;U48R).Além disso, enquanto o Contexto A possui piso ripado antivibrático com paredes de aço inoxidável e plexiglass, o Contexto B contém inserções metálicas pintadas colocadas no piso e nas paredes.A forma do Contexto B também foi modificada pela colocação de uma inserção de metal curvo de 33,5 cm x 21,3 cm em uma câmara de condicionamento padrão.Além disso, no contexto A as câmaras foram limpas com ácido acético a 5%, enquanto no contexto B as câmaras foram limpas com hidróxido de amônio a 5%.Finalmente, no contexto B, os ratos foram levados para a sala de teste em baldes, em vez de serem empurrados em gaiolas em carrinhos.As sessões comportamentais foram gravadas com a câmera superior e o sinal de vídeo de cada câmera foi inserido no software (FreezeScan 2.00, Clever Sys. Inc., Reston, VA) que avaliou o comportamento de desbotamento com base nas alterações de pixel.Os parâmetros foram escolhidos de forma que o comportamento do desvanecimento estimado pelo computador se aproximasse do comportamento de observadores treinados estimados manualmente.Um valor que indica a porcentagem de tempo de congelamento acumulado em um intervalo de 30 segundos.
Todos os programas comportamentais são executados durante a parte clara do ciclo claro/escuro.Os ratos foram tratados 5 dias antes do início dos procedimentos comportamentais e transportados para a sala comportamental para os últimos três dias de tratamento.No primeiro dia de teste comportamental, um grupo de ratos de recuperação de extinção foi colocado em um reflexo condicionado pelo medo, então colocado no contexto A, dado um período de aclimatação não estimulada de 6 min, e então dado ambas as combinações de 4 kHz, 76 dB, 30 s .tom e finalização geral, 1,0 mA, kick 1 s (2 min ITI).Para todos os treinamentos comportamentais, os ratos foram devolvidos às gaiolas 2 min após a última apresentação do estímulo.No dia seguinte, ratos do grupo extinção-revocação foram colocados na sala de contexto B e realizaram 20 apresentações sonoras (2 min ITI) como treinamento de extinção após um período de habituação de 6 min.No dia seguinte, os ratos do grupo de reprodução em extinção foram expostos a 4 tons no contexto B após um período de aclimatação de 6 minutos como teste de extinção.Os ratos do grupo de memória de extinção foram perfundidos 60 minutos após a sessão comportamental.Um grupo de ratos controle evocando memórias de medo foi submetido ao mesmo procedimento no primeiro dia da resposta condicionada ao medo no contexto A. Quarenta e oito horas depois, os ratos foram colocados na sala de contexto B e submetidos a 4 apresentações de áudio (2- minuto ITI) como um teste de recordação.medo após um período de aclimatação de 6 minutos.Os ratos foram perfundidos 60 minutos após a sessão comportamental.Um grupo de ratos domésticos de controle permaneceu em suas gaiolas durante todo o experimento e foi perfundido no mesmo dia que os ratos experimentais.Cada um dos dois grupos de ratos foi dividido em duas séries, e o número de animais em cada grupo foi equilibrado entre as séries.Um rato do grupo de memórias de medo foi excluído da análise porque não apresentou sinais de condicionamento de medo (congelando menos de 15% do tempo durante o teste de memórias de medo).Consulte a Figura 2A para obter um diagrama da linha do tempo comportamental.
Os ratos foram superdosados ​​com solução Fatal Plus (100 mg/kg), então perfundidos com PBS a 10% gelado seguido de formalina tamponada a 10%.O cérebro foi removido e armazenado em solução de sacarose a 30% em formalina a 4°C por cerca de 1 semana.Em seguida, o cérebro foi congelado e cortado em um criostato de 40 µm de espessura.As seções foram armazenadas sequencialmente em PBS a 10% a 4°C.Em seguida, a imunofluorescência foi realizada em seções flutuantes contendo a região do cérebro de interesse.Os cortes foram lavados 3 vezes em PBS 10% por 5 min cada.Os cortes foram então incubados em solução bloqueadora de soro normal de cabra a 5% por 2 horas em temperatura ambiente, e então lavados mais três vezes por 5 minutos cada em PBS a 10%.As seções foram então incubadas durante a noite a 4° C em anticorpos primários (c-Fos, #2250, 1:500) (Cell Signaling, Danvers, MA) diluídos em 1% BSA em 10% PBS.No dia seguinte, os cortes foram lavados em PBS 10% por 30 min a 4°C, depois 3 vezes por 5 min em PBS 10% e incubados com um anticorpo secundário (Alexa Fluor 594 anti-coelho de cabra, conjugado vermelho, 1:500 ).) (Invitrogen, Carlsbad, CA) à temperatura ambiente durante 2 horas.Após 3 lavagens adicionais em PBS a 10% por 5 minutos, as seções foram colocadas em lâminas de vidro e seladas com Fluoromount-G (Invitrogen).Veja imagens representativas de imunocoloração na Figura 3G.
Um microscópio fluorescente usando uma câmera digital Infinity3 (Lumenera, Ottawa, Ontário, Canadá) e um motor de luz (Lumencor, Beaverton, OR) conectado a um microscópio Zeiss foi usado para adquirir imagens de cada região do cérebro de interesse, incluindo seções contendo IL sem imunofluorescência.realizada para confirmar a colocação correta do local da injeção.As imagens utilizadas para contagem de células foram obtidas com aumento de 20x.Para cada seção de tecido, tire uma imagem com um filtro que permita a visualização de GFP e uma imagem com um filtro que permita a visualização do conjugado Alexa Fluor red no anticorpo secundário, e o software de imagem (Infinity Analyze, versão 3) foi usado para imagem overlay.Adquira todas as imagens de todas as áreas do cérebro usando o mesmo tempo de exposição e configurações de ganho.Seis ratos foram excluídos da análise porque a principal transmissão do vírus ocorreu fora da TI (taxa de acerto de 88%).Mais oito ratos foram excluídos porque, apesar do vírus atacar IL, eles não mostraram expressão suficiente de GFP em todas as regiões cerebrais alvo de interesse.Além disso, um rato foi excluído devido à má qualidade do tecido.
Ajuste o brilho e o contraste para reduzir o ruído de fundo na imagem J (NIH) usando o mesmo procedimento para cada imagem.As contagens de células para o total de células marcadas retrógradas, total de células marcadas com Fos e total de células duplamente marcadas foram realizadas manualmente pelo experimentador, que não identificou os animais, usando o plug-in Image J citômetro.As contagens de células foram normalizadas para células/mm2.Para analisar a expressão de Fos em células que projetam IL, o número de células duplamente marcadas foi normalizado para o número total de células marcadas retrógradas.Para análise de mBLA, mvHPC e pvHPC, as contagens de células de múltiplas imagens 20x foram somadas e normalizadas para células/mm2.Para análise do resto das regiões cerebrais, uma imagem de 20x ou uma parte de uma imagem de 20x foi analisada e normalizada para células/mm2.A análise vHPC incluiu regiões CA1, CA2 e vHPC subdominantes.A Figura 1 mostra as regiões do cérebro analisadas com imagens delineando a borda ântero-posterior do plano.
Abreviaturas e localização de regiões cerebrais de interesse.Explicação das abreviações e localizações das regiões do cérebro fornecidas no manuscrito.Mapa cerebral de domínio público retirado de Swanson (2004) Brain Map: Structure of the Rat Brain, 3rd Edition, licenciado sob uma Licença Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/ 4.0) ./), disponível para download em https://larrywswanson.com.
A porcentagem do tempo de congelamento é calculada em média durante um período de reprodução de tom de 30 segundos, excluindo intervalos intermediários.As taxas de recuperação de extinção foram calculadas expressando a porcentagem de tempo de desaparecimento durante a recuperação de extinção como a porcentagem de desaparecimento durante as primeiras 4 tentativas de treinamento de extinção (desvanecimento durante quatro tons de recuperação de extinção/desvanecimento durante os primeiros quatro tons de treinamento de extinção * 100).Pontuações baixas indicam boa memória de fade e pontuações altas indicam memória de fade ruim.Os ratos foram classificados por pontuação de recordação de extinção, com ratos no terço superior da pontuação de recordação de extinção classificados como “ratos de extinção ruins” e ratos nos últimos dois terços da pontuação de recordação de extinção foram classificados como “bons”.Ratos com perda de memória.
Testes não paramétricos são usados ​​porque os dados muitas vezes violam suposições sobre distribuição normal e/ou homogeneidade de variâncias.A correlação de classificação de Spearman foi usada para determinar se havia uma associação significativa entre os escores de memória de extinção e marcadores Fos e marcadores duplos em regiões cerebrais de interesse em todos os ratos submetidos ao teste de memória de extinção.O teste U de Mann-Whitney foi usado para determinar se havia diferença entre dois grupos independentes.O teste de Kruskal-Wallis é usado para determinar se 2 ou mais grupos diferem entre si, e o teste de comparação múltipla de Dunn é usado quando a estatística de Kruskal-Wallis é significativa.O desvanecimento durante o aprendizado da extinção foi avaliado usando análise de variância de medidas repetidas com o grupo como fator intersujeito e o teste como fator intrassujeito. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05 para todos os testes estatísticos. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05 para todos os testes estatísticos. Результаты считались значимыми при p < 0,05 для всех статистических тестов. Os resultados foram considerados significativos com p < 0,05 para todos os testes estatísticos.当所有统计检验的p < 0,05 时，结果被认为是显着的。当所有统计检验的p < 0,05 时，结果被认为是显着的。 Результаты считались значимыми при p < 0,05 для всех статистических тестов. Os resultados foram considerados significativos com p < 0,05 para todos os testes estatísticos.
A Figura 2 mostra a linha do tempo experimental (Figura 2A) e a distribuição de frequência de todos os ratos submetidos à extinção (Figura 2B). Os ratos nos grupos de extinção boa e ruim diferiram significativamente nesses escores calculados de recuperação de extinção (U = 0, p < 0,001) (Fig. 2C). Os ratos nos grupos de extinção boa e ruim diferiram significativamente nesses escores calculados de recuperação de extinção (U = 0, p < 0,001) (Fig. 2C). Крысы в ​​​​группах с хорошим и плохим угашением значительно различались по этим рассчитанным показателям припоминания угашения (U = 0, p <0,001) (рис. 2C). Os ratos nos grupos de extinção boa e ruim diferiram significativamente nessas taxas de recuperação de extinção calculadas (U=0, p<0,001) (Figura 2C).2C U = 0，p <0,001）（图2C， В этих рассчитанных показателях припоминания угашения крысы в ​​​​группах с хорошим и плохим угашением значительно различались (U = 0, p <0,001) (рис. 2C). Nessas taxas de recuperação de extinção calculadas, os ratos nos grupos de extinção boa e ruim diferiram significativamente (U = 0, p < 0,001) (Figura 2C).Não houve diferença significativa no tempo de congelamento entre os grupos com boa extinção, extinção ruim e recordação do medo durante o período base da sessão de reflexo condicionado pelo medo (X2(2) = 2,746, p = 0,253) (Figura 2D).Além disso, durante a apresentação do primeiro tom do reflexo condicionado ao medo, não houve diferença significativa no tempo de congelamento entre os grupos com extinção boa, extinção ruim e recordação do medo (X2(2) = 1,107, p = 0,575), conforme bem como durante o medo durante os segundos tons.Durante a sessão de condicionamento, houve diferença significativa no tempo de congelamento entre os grupos com extinção boa, extinção ruim e recordação de medo (X2(2) = 2,214, p = 0,331) (Figura 2D).Também não houve diferença significativa no tempo de desaparecimento entre os grupos de extinção boa e ruim durante o período de treinamento de extinção inicial (U = 45,00, p = 0,799) (Figura 2D). Em seguida, houve um efeito principal significativo do bloco experimental (5 tons por bloco) no tempo gasto para congelar durante a sessão de treinamento de extinção (F (2,884, 54,80) = 8,331, p < 0,001), indicando que ocorreu aprendizado de extinção (Fig. 2D ). Em seguida, houve um efeito principal significativo do bloco experimental (5 tons por bloco) no tempo gasto para congelar durante a sessão de treinamento de extinção (F (2,884, 54,80) = 8,331, p < 0,001), indicando que ocorreu aprendizado de extinção (Fig. 2D ). Затем наблюдался значительный основной эффект пробного блока (5 тонов на блок) на время, затрачиваемое на замирание во время тренировки угашения (F (2,884, 54,80) = 8,331, p <0,001), что указывает на то, что обучение угашению происходило ( рис. 2D). Houve então um efeito principal significativo do bloco experimental (5 tons por bloco) no tempo necessário para congelar durante o treinamento de extinção (F(2,884, 54,80) = 8,331, p < 0,001), indicando que o aprendizado da extinção estava ocorrendo (Fig. . 2D). ).接下来 ， 在 消退 期间 ， 试块 （每 块 5 音） 对 时间 时间 有 显着 的 主 （f （2.884 ）54.80） = 8,331 ， p <0,001） ， 表明 发生 了 消退 学习 （2d 。接下来 ， 在 消退 期间 ， 试块 （每 块 5 音） 对 时间 时间 有 显着 的 主 （f （2.884 ）54.80） = 8,331 ， p <0,001） ， 表明 发生 了 消退 学习 （2d 。 Затем, во время обучения угашению, пробные блоки (5 тонов на блок) оказали значительное основное влияние на время замирания (F (2,884, 54,80) = 8,331, p <0,001), что указывает на то, что обучение угашению происходило (рис . 2D). Então, durante o aprendizado de extinção, os blocos de teste (5 tons por bloco) tiveram um efeito principal significativo no tempo de fade (F(2,884, 54,80) = 8,331, p <0,001), indicando que o aprendizado de extinção estava ocorrendo (Fig. .2D) .No entanto, o grupo de extinção (F(1, 19) = 3,091, p = 0,095) não teve efeito significativo no tempo de desaparecimento durante todo o período de treinamento de extinção e não houve interação entre o bloco experimental e o grupo de extinção (F(4 , 19)) .76) = 1,890, p = 0,121) (Fig. 2D). Durante a sessão de teste, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim e memória de medo no tempo gasto paralisado durante o período de linha de base (X2 (2) = 8,569, p = 0,014), de modo que o grupo de memória de medo congelou significativamente mais do que o grupo de extinção boa (Mean Rank Diff. = 10,57, p = 0,017), mas não o grupo de extinção ruim (Mean Rank Diff. = − 3,714, p > 0,999) (Fig. 2D). Durante a sessão de teste, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim e memória de medo no tempo gasto paralisado durante o período de linha de base (X2 (2) = 8,569, p = 0,014), de modo que o grupo de memória de medo congelou significativamente mais do que o grupo de extinção boa (Mean Rank Diff. = 10,57, p = 0,017), mas não o grupo de extinção ruim (Mean Rank Diff. = − 3,714, p > 0,999) (Fig. 2D).Durante a sessão de teste, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim e memória de medo no tempo gasto paralisado durante o período de linha de base (X2(2) = 8,569, p = 0,014), de modo que o grupo de memória de medo congelou significativamente.больше, чем в группе хорошего вымирания (средняя разница рангов = 10,57, p = 0,017), но не в группе плохого вымирания (средняя разница рангов = -3,714, p> 0,999) (рис. 2D). maior do que no grupo de extinção boa (diferença de classificação média = 10,57, p = 0,017), mas não no grupo de extinção ruim (diferença de classificação média = −3,714, p > 0,999) (Figura 2D).在 期间 ， 良好 消退组 、 不良 消 和 恐惧 回忆组 在 基线期 冻结 时间 方面 存在 显着 （x2 (2) = 8,569 ， p = 0,014） ， 因此 恐惧 回忆组 显着 显着 超过 的 灭绝 灭绝 组 ， ， 因此 恐惧 回忆组 显着 超过 良好 的 灭绝 组 组 ， ， 因此 回忆组 冻结 显着 超过 良好 的 灭绝 组 组 ， 因此 恐惧 回忆组 冻结 显着 超过 的 灭绝 灭绝 组（平均秩差= 10,57，p = 0,017），但不是差的灭绝组（平均秩差= – 3,714，p > 0,999）（图2D）。在 期间 ， 良好 消退组 、 消 退组 恐惧 在 基线期 冻结 时间 方面 存在 显着 （（（x2 (2) = 8,569 ， p = 0,014） ， 恐惧 回忆组 冻结 显着 的 的 组 组 组） 组 ， 恐惧 回忆组 冻结 显着 的 组 组 组 组） ， ， 恐惧 冻结 显着 良好 的 组 组 组 组 组 ， ， 回忆组 冻结 显着 良好 的 组 组 组 组 组 ，组 组 组 (平均秩差= 10,57, p = 0,017), В течение периода тестирования наблюдалась значительная разница между группой с хорошим угашением, группой с плохим угашением и группой с припоминанием страха с точки зрения времени замирания на исходном уровне (X2 (2) = 8,569, p = 0,014), поэтому припоминание страха группа замерзает значительно чаще , чем группа с хорошим вымиранием (средняя разница рангов = 10,57, p = 0,017), но не группа с плохим вымиранием (средняя разница рангов = -3,714, p> 0,999) (рис. 2D). Durante o período de teste, houve uma diferença significativa entre o grupo de extinção boa, o grupo de extinção ruim e o grupo de recordação de medo em termos de tempo de congelamento na linha de base (X2(2) = 8,569, p = 0,014). o grupo congela significativamente com mais frequência do que o grupo com boa extinção (diferença média de classificação = 10,57, p = 0,017), mas não o grupo com extinção ruim (diferença média de classificação = -3,714, p > 0,999) (Figura 2D).O grupo de extinção boa, o grupo de extinção ruim e o grupo de recordação do medo também tiveram tempos de desvanecimento significativamente diferentes durante a apresentação do tom da sessão de teste (X2(2) = 14,93, p = 0,001), então o grupo de extinção boa teve significativamente menos Tempo.tempo de congelamento do que no grupo de extinção fraca (diferença de classificação média = 9,286, p = 0,044) e no grupo de memória de medo (diferença de classificação média = 13,86, p = 0,001) (Fig. 2D).
Diferenças individuais na lembrança da extinção.(A) Esboço de procedimentos cirúrgicos e comportamentais.(B) Distribuição de frequência mostrando diferenças individuais nas pontuações de memória de fuga.(C) Evidência de que grupos projetados com base em pontuações calculadas de recuperação de extinção representam dois fenótipos diferentes.(D) Porcentagem média de tempo que os ratos congelam para extinção ruim, extinção boa e recordação de medo em células de 30 segundos de uma sessão de reflexo de medo condicionado, em tons de 20, 30 s, colapsados ​​em 5 blocos durante a sessão de aprendizagem de extinção (4 tons) .cada), e em quatro tons em sessões de memórias de desvanecimento e memórias de medo.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. *р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001, ****р < 0,0001. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. *p < 0,05，**p < 0,01，***p < 0,001，****p < 0,0001。 *p < 0,05，**p < 0,01，***p < 0,001，****p < 0,0001。 *р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001, ****р < 0,0001. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.
Um indicador retrógrado foi injetado no IL (Fig. 3A) e o número de células GFP+ ao longo do eixo ântero-posterior da região de interesse foi determinado (Fig. 3B-F).Houve uma diferença significativa no número de células GFP+ entre PVT anterior, médio e posterior (X2(2) = 8,200, p = 0,017), então mPVT mostrou significativamente mais células GFP+ do que aPVT (classificação média) Diff.= 18,37, p = 0,035) e pPVT (diferença média de classificação = 17,71, p = 0,045) (Fig. 3C).Embora vários animais não detectassem nenhuma célula GFP+ em pCLA e, portanto, não pudessem mapear a atividade nessa região, não houve diferença significativa entre CLA anterior, médio e posterior (X2(2) = 5,596, p = 0,061).Número de células GFP+ (Figura 3D).Então, como algumas células GFP+ foram encontradas em aBLA ou avHPC em vários ratos, apenas o meio e o verso dessas áreas foram analisados.O BLA médio e posterior (U=393, p=0,009) diferiram significativamente no número de células GFP+, então o pBLA apresentou mais projeções de IL do que o mBLA (Figura 3E).Da mesma forma, houve uma diferença significativa entre os vHPCs médios e posteriores, de modo que os pvHPCs mostraram mais projeções de IL do que os mvHPCs (U = 403,5, p = 0,014) (Figura 3F).A Figura 3G é uma imagem exemplar mostrando Fos, aavRG-GFP e células duplamente marcadas.
Quantifique os aferentes IL em toda a região do cérebro de interesse.(A) Representação esquemática da distribuição de aavRG-CAG-GFP em ratos inteiros IL.(B) Imagens representativas de marcadores retrógrados em diferentes locais anteroposteriores na região do cérebro de interesse.Quantificação da marcação retrógrada ao longo do eixo anteroposterior (C) tálamo paraventricular, (D) clavícula, (E) tonsila basolateral e (F) hipocampo ventral.(G) Imagens representativas mostrando rotulagem aavRG retrógrada, rotulagem Fos e dupla aavRG e rotulagem Fos em aPVT.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05, **p < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01. *р < 0,05, **р < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01. *p < 0,05，**p < 0,01。 *p < 0,05，**p < 0,01。 *р < 0,05, **р < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01.Barra de escala 100 µm.O mapa cerebral de domínio público no painel A é reproduzido de Swanson (2004) Brain Map: Rat Brain Structure, 3rd Edition, licenciado sob a Creative Commons Attribution-NonCommons 4.0 International License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc )./4.0/) disponível para download em https://larrywswanson.com.
A atividade Fos específica de projeção global e IL foi analisada em aPVT, mPVT e pPVT em todos os ratos.Não houve diferença significativa entre boa extinção, extinção ruim, lembrança de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em aPVT (X2(3) = 3,888, p = 0,274) (Fig. 4A), nem houve uma correlação significativa entre Fos em aPVT entre expressão e recuperação de extinção (rs = 0,092, p = 0,691) (Figura 4B) ou entre expressão de Fos em aferentes de aPVT IL e recuperação de extinção (rs = 0,143, p = 0,537) (Figura 4D).No entanto, em aferentes de aPVT IL, a expressão de Fos diferiu significativamente entre boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e grupos de células domésticas (X2(3) = 15,05, p = 0,002), de modo que o grupo de recordação de medo mostrou extinção relativamente boa.grupos de regressão (diferença de classificação média = 11,54, p = 0,003), regressão ruim (diferença de classificação média = 10,57, p = 0,034) e célula inicial (diferença de classificação média = 12,79, p = 0,005) (Fig. 4C).Além disso, não houve diferença significativa entre extinção boa, extinção ruim, lembrança de medo e grupos de células domésticas para expressão de Fos em mPVT (X2(3) = 2,272, p = 0,518) (Fig. 4E) e para expressão de Fos em mPVT..Correlação significativa com a recordação da extinção (rs = 0,168 p = 0,468) (Figura 4F).Embora houvesse uma diferença significativa entre os grupos bom, ruim, de memória de medo e de células domésticas na expressão de Fos em células mPVT aferentes de IL (X2(3) = 9,252, p = 0,026), a comparação post hoc não revelou nenhum ou dois.Diferenças significativas entre os grupos (Figura 4G).Além disso, não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em células IL-aferentes mPVT e recuperação de extinção (rs = 0,174, p = 0,450) (Figura 4H). Em seguida, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, lembrança de medo e gaiola doméstica na expressão de Fos no pPVT (X2 (3) = 13,89, p = 0,003), de modo que o grupo de boa extinção (Mean Rank Diff. = 14,96, p = 0,010), mas não a extinção pobre (Mean Rank Diff. = 12,86, p = 0,113) ou o grupo de recordação de medo (Mean Rank Diff. = 2,571, p > 0,999), exibiu mais expressão de Fos do que o grupo gaiola casa (Fig. 4I). Em seguida, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, lembrança de medo e gaiola doméstica na expressão de Fos no pPVT (X2 (3) = 13,89, p = 0,003), de modo que o grupo de boa extinção (Mean Rank Diff. = 14,96, p = 0,010), mas não a extinção pobre (Mean Rank Diff. = 12,86, p = 0,113) ou o grupo de recordação de medo (Mean Rank Diff. = 2,571, p > 0,999), exibiu mais expressão de Fos do que o grupo gaiola casa (Fig. 4I). Далее, наблюдалась значительная разница между группами с хорошим угасанием, плохим угашением, отзывом страха и домашней клеткой в ​​​​экспрессии Fos в pPVT (X2 (3) = 13,89, p = 0,003), так что группа с хорошим угашением (средний ранг Diff. = 14,96, p = 0,010), но не в группе плохого угашения (средняя ранговая разница = 12,86, p = 0,113) или группы воспоминаний о страхе (средняя ранговая разница = 2,571, p > 0,999), демонстрировалась более выраженная экспрессия Fos, чем в группе группа домашних клеток (рис. 4I). Além disso, houve uma diferença significativa entre extinção boa, extinção ruim, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em pPVT (X2(3)=13,89, p=0,003), de modo que o grupo de extinção boa (diferença média de classificação = 14,96, p = 0,010), mas não no grupo de extinção pobre (diferença de classificação média = 12,86, p = 0,113) ou no grupo de memória de medo (diferença de classificação média = 2,571, p > 0,999), mostrou expressão de Fos mais pronunciada do que em o grupo de células domésticas (Figura 4I).其次 ， ppvt 中 fos 表达 消 消 差消 、 恐惧 和 家笼组 之间 存在 显着 差异 （x2 （3） = 13,89 ， p = 0,003） 使得 消组 （（de classificação média difff.= 14,96, p = 0,010)，但不是较差的消退(Mean Rank Diff. = 12,86, p = 0,113) 或恐惧回忆组(Mean Rank Diff. = 2,571, p > 0,999) ）。= 14,96, p = 0,010)，但不是较差的消退(Mean Rank Diff. = 12,86, p = 0,113) ）。Em segundo lugar, houve diferenças significativas na expressão de Fos em pPVT entre os grupos bom, ruim, recordação de medo e células domésticas (X2(3) = 13,89, p = 0,003), tornando o grupo de boa ingestão (diferença média de classificação = 14,96)., p = 0,010), но не хуже по угашению (средняя разница рангов = 12,86, p = 0,113) или группе отзыва страха (средняя разница рангов = 2,571, p > 0,999), чем в группе домашней клетки (рис. 4I) . , p = 0,010), mas não pior em extinção (diferença média de classificação = 12,86, p = 0,113) ou grupo de lembrança de medo (diferença média de classificação = 2,571, p> 0,999) do que o grupo de células domésticas (Figura 4I)..No entanto, não houve correlação significativa entre a expressão de pPVT Fos e a recuperação da extinção (rs = 0,051, p = 0,825) (Figura 4J).Finalmente, houve uma diferença significativa na expressão de Fos em aferentes pPVT IL entre os grupos com boa extinção, extinção pobre, memórias de medo e em células domésticas (X2(3) = 12,34 p = 0,006), então a boa expressão de Fos em IL- foi pior do que nos grupos de extinção (diferença de classificação média = 12,54, p = 0,014) e na célula inicial (diferença de classificação média = 12,89, p = 0,049) (Fig. 4K) e significativamente correlacionada com aferentes IL dentro de pPVT Entre ativação e revogação da extinção, melhor recuperação da extinção foi associada a maior ativação desses aferentes de IL (rs = -0,438, p = 0,047) (Figura 4L).
A atividade de Fos foi aumentada em aferentes de IL do tálamo paraventricular posterior (PVT) em ratos, que mostraram boa regressão.(A) Não houve diferenças significativas entre os grupos na expressão de Fos em aPVT.(B) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recuperação da extinção em aPVT.(C) O grupo de memória de medo mostrou aumento da expressão de Fos em aferentes de IL em comparação com todos os outros grupos.(D) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recuperação da extinção em aPVT.(E) Não houve diferenças significativas entre grupos na expressão de Fos em mPVT.(F) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a memória de extinção no mPVT.(G) A expressão de Fos em células IL aferentes em mPVT não diferiu significativamente entre os grupos.(H) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recuperação da extinção em mPVT.(I) Um grupo bem extinto, mas nenhum outro grupo, mostrou aumento da atividade de Fos no pPVT em comparação com o grupo da gaiola doméstica.(J) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recuperação da extinção no pPVT.(K) O grupo de extinção boa mostrou aumento da expressão de Fos em células aferentes de IL em comparação com o grupo de extinção fraca e o grupo de células domésticas.(L) Existe uma correlação significativa entre a expressão de Fos nos aferentes IL e a recuperação da extinção, portanto, uma boa recuperação da extinção está associada a uma maior expressão de Fos nos aferentes IL.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05, **p < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01. *р < 0,05, **р < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01. *p < 0,05，**p < 0,01。 *p < 0,05，**p < 0,01。 *р < 0,05, **р < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01.
A atividade Fos global e específica da projeção IL em aCLA e mCLA de ratos foi então analisada em todos os grupos. Houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, lembrança de medo e gaiola doméstica na expressão de Fos no aCLA (X2 (3) = 8,455, p = 0,036), de modo que o grupo de lembrança de medo (Mean Rank Diff. = 14,50, p = 0,049), mas nem os grupos pobres (Mean Rank Diff. = 10,21, p = 0,373) nem bons grupos de extinção (Mean Rank Diff. = 4,607, p > 0,999) exibiram mais expressão de Fos do que o grupo gaiola doméstica ( Fig. 5A). Houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, lembrança de medo e gaiola doméstica na expressão de Fos no aCLA (X2 (3) = 8,455, p = 0,036), de modo que o grupo de lembrança de medo (Mean Rank Diff. = 14,50, p = 0,049), mas nem os grupos pobres (Mean Rank Diff. = 10,21, p = 0,373) nem bons grupos de extinção (Mean Rank Diff. = 4,607, p > 0,999) exibiram mais expressão de Fos do que o grupo gaiola doméstica ( Fig. 5A). Между группами с хорошим угашением, плохим угашением, припоминанием страха и домашними клетками наблюдалась значительная разница в экспрессии Fos в aCLA (X2 (3) = 8,455, p = 0,036), так что группа припоминания страха (среднее ранговое различие = 14,50, p = 0,049), но ни плохая (средняя ранговая разница = 10,21, p = 0,373), ни группа с хорошим вымиранием (средняя ранговая разница = 4,607, p > 0,999) не демонстрировали большей экспрессии Fos, чем группа в домашней клетке ( Рис . 5A). Houve uma diferença significativa na expressão de aCLA Fos entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, memória de medo e células domésticas (X2(3) = 8,455, p = 0,036), de modo que o grupo de memória de medo (diferença média de classificação = 14,50, p = 0,049), mas nem os pobres (diferença média de classificação = 10,21, p = 0,373) nem o bom grupo de extinção (diferença média de classificação = 4,607, p> 0,999) mostraram mais expressão de Fos do que o grupo de células domésticas (Fig. .5A) . acla 中 fos 表达 良好 消退 、 消退差 、 恐惧 回忆 和 家庭 笼组 之间 存在 显着 差异 (x2 (3) = 8,455, p = 0,036) ， 因此 回忆组 回忆组 (classificação média de classificação. 0,049） ， 但 差 （（平均 秩差 = 10,21 ， p = 0,373） 还是 灭绝 （（平均 秩差 = 4,607 ， p> 0,999） 组 ， 都 显示 出 出 家庭 笼组 更 多 的 的 表达 ， 都 都 显示 出 比 家庭 笼组 更 多 的 fos 表达 ， 都 都 显示 出 出 家庭 笼组 更 多 的 的 表达 ， 图 都 ​​显示 显示 出 比。 Acla 中 fos 表达 消退 、 消退差 、 回忆 和 家庭 笼组 之间 显着 显着 差异 差异 差异 差异 差异 (x2 (3) = 8,455, p = 0,036) ， 因此 恐惧 回忆组 回忆组 回忆组 回忆组 (média Diff. 0,999) 组 都 出 比 家庭 笼组 更 多 的 表达 图 图 图 5a) 。 Была значительная разница между группами с хорошим угашением, плохим угашением, отзывом страха и домашней клеткой по экспрессии Fos в aCLA (X2(3) = 8,455, p = 0,036), поэтому группа отзыва страха (среднее ранговое различие = 14,50) , p = 0,049), но группы с плохим (средняя разница рангов = 10,21, p = 0,373) и с хорошим вымиранием (средняя разница рангов = 4,607, p > 0,999) показали более высокую экспрессию Fos, чем группа с домашней клеткой (рис. 5A). Houve uma diferença significativa entre extinção boa, extinção ruim, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de aCLA Fos (X2(3) = 8,455, p = 0,036), portanto, grupo de recordação de medo (diferença média de classificação = 14,50), p = 0,049 ), mas grupos com extinção ruim (diferença de classificação média = 10,21, p = 0,373) e boa (diferença de classificação média = 4,607, p > 0,999) mostraram maior expressão de Fos do que o grupo de células domésticas (Fig. 5A). .Não houve correlação significativa entre a expressão global de Fos em (rs = 0,036, p = 0,876) (Figura 5B) ou expressão de Fos em células aferentes IL aCLA (rs = -0,282, p = 0,215) e recuperação de extinção (Figura 5B)..5D), também não houve diferença significativa entre extinção boa, extinção ruim, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em aferentes aCLA IL (X2(3) = 6,722, p = 0,081) (Figura 5C)..). Em seguida, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, lembrança de medo e gaiola doméstica na expressão de Fos no mCLA (X2 (3) = 10,12, p = 0,018), de modo que o grupo de boa extinção (Mean Rank Diff . = 12,93, p = 0,038), mas nem a extinção pobre (Mean Rank Diff. = 5,143, p > 0,999) nem os grupos de memória de medo (Mean Rank Diff. = 14,00, p = 0,063) exibiram significativamente mais expressão de Fos no mCLA em relação ao grupo gaiola casa (Fig. 5E). Em seguida, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, lembrança de medo e gaiola doméstica na expressão de Fos no mCLA (X2 (3) = 10,12, p = 0,018), de modo que o grupo de boa extinção (Mean Rank Diff . = 12,93, p = 0,038), mas nem a extinção pobre (Mean Rank Diff. = 5,143, p > 0,999) nem os grupos de memória de medo (Mean Rank Diff. = 14,00, p = 0,063) exibiram significativamente mais expressão de Fos no mCLA em relação ao grupo gaiola casa (Fig. 5E). Затем наблюдалась значительная разница между группами с хорошим угашением, плохим угашением, воспоминаниями о страхе и домашней клеткой в ​​​​экспрессии Fos в mCLA (X2 (3) = 10,12, p = 0,018), так что группа с хорошим угашением (средняя разница рангов . = 12,93, p = 0,038), но ни группы плохого угашения (средняя ранговая разница = 5,143, p > 0,999), ни группы отзыва страха (средняя ранговая разница = 14,00, p = 0,063) не показали значительно большей экспрессии Fos в mCLA. Houve então uma diferença significativa entre boa extinção, extinção ruim, memórias de medo e grupos de células domésticas na expressão de mCLA Fos (X2(3) = 10,12, p = 0,018), de modo que o grupo de boa extinção (classificação média da diferença = 12,93, p = 0,038), mas nem os grupos de extinção pobre (diferença de classificação média = 5,143, p > 0,999) nem os grupos de memória de medo (diferença de classificação média = 14,00, p = 0,063) mostraram expressão de Fos significativamente maior em mCLA.em comparação com o grupo gaiola em casa (Figura 5E).接下来 ， mcla 中 fos 表达 ， 良好 、 不良 消 退组 、 恐惧 回忆组 家庭 笼组 之间 显着 （（x2 （3） = 10,12 ， p = 0,018） ， 良好 （（（（（（（（（（（（（， ， （（（ Média Rank Diff .= 12,93, p = 0,038) ， 但 在 mcla 中 ， 弱消退 （平均 秩差 = 5,143 ， p> 0,999） 和 恐惧 （（平均 秩差 = 14,00 ， p = 0,063） 均 未 出 更 多 的 ， fos 表达相对于家庭笼组 (图5E)。 = 12,93, p = 0,038) ， 在 在 mcla 中 ， 弱消退 （平均 秩差 秩差 秩差 = 5.143 ， p> 0,999） 和 （（平均 秩差 = 14,00 ， p = 0,063） 未 显示 出 多 多 的 ， fos 表达 表达 的 fos 表达 表达 的 fos 表达相对于家庭笼组（图5E）。 Далее, в экспрессии Fos в mCLA наблюдалась значительная разница между группой с хорошим угасанием, группой с плохим угасанием, группой с отзывом о страхе и группой с домашней клеткой (X2(3) = 10,12, p = 0,018), так, группа хорошего угашения (средняя разность рангов = 12,93, p = 0,038), но в mCLA ни слабое угасание (средняя разница рангов = 5,143, p > 0,999), ни группа отзыва страха (средняя разница рангов = 14,00, p = 0,999) = 0,063). Além disso, houve uma diferença significativa na expressão de Fos em mCLA entre o grupo de boa extinção, o grupo de extinção ruim, o grupo de feedback de medo e o grupo de células domésticas (X2(3) = 10,12, p = 0,018), portanto, o bom extinção (diferença de classificação média = 12,93, p = 0,038), mas em mCLA nem a extinção fraca (diferença de classificação média = 5,143, p > 0,999) nem o grupo de lembrança de medo (diferença de classificação média = 14,00, p = 0,999) = 0,063) mostraram melhor Expressão Multi Fos em comparação com o grupo de células domésticas (Figura 5E).No entanto, a expressão global de Fos em mCLA (rs = 0,321, p = 0,156) (Fig. 5F) ou em células IL mCLA aferentes (rs = -0,121, p = 0,602) e recuperação de extinção (Fig. 5H), nenhuma diferença significativa entre grupos com boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e uma célula inicial para expressão de Fos em células aferentes IL mCLA (X2(3)=4,923, p=0,178) (Figura 5G).
A atividade de Fos foi elevada no meio do claustro em ratos com boa memória de extinção.(A) O grupo de recordação de medo, mas não os outros grupos, mostrou aumento da atividade de Fos em comparação com o grupo de células domésticas em aCLA.(B) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aCLA e a recuperação da extinção.(C) A expressão de Fos em células aCLA aferentes de IL não diferiu significativamente entre os grupos.(D) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recuperação da extinção em aCLA.(E) O grupo bem extinto, mas não os outros grupos, mostrou aumento da atividade de Fos no mCLA em comparação com o grupo de células domésticas.(F) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recuperação da extinção em mCLA.(G) A expressão de Fos em células aferentes de IL mCLA não diferiu significativamente entre os grupos.(H) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recuperação da extinção em mCLA.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05. *p < 0,05. *r < 0,05. *p < 0,05. *p < 0,05。 *p < 0,05。 *r < 0,05. *p < 0,05.
Em seguida, a atividade Fos global e específica da projeção de IL em mBLA e pBLA foi analisada em todos os grupos de ratos.Não houve diferença significativa entre extinção boa, extinção ruim, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em mBLA (X2(3)=0,944, p=0,815) (Figura 6A).Também não houve diferença significativa entre os grupos com boa regressão, regressão ruim, memória de medo e expressão de Fos nas células domésticas em células aferentes de IL mBLA (X2(3)=0,518, p=0,915) (Figura 6C).Além disso, não houve correlação significativa entre a expressão global de Fos em mBLA (rs = 0,126, p = 0,588) (Figura 6B) e a expressão de Fos em células aferentes IL mBLA (rs = 0,200, p = 0,385) (rs = 0,200, p = 0,385).p = 0,385).Figura 6D) e recuperação de extinção.Também não houve diferença significativa na extinção boa, extinção ruim, memória do medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em pBLA (X2(3) = 4,246, p = 0,236) (Fig. 6E), e também não houve diferença significativa em pBLA Bom.extinção, extinção fraca, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em células aferentes IL (X2(3)=1,954, p=0,582) (Figura 6G).Finalmente, expressão global de Fos em pBLA (rs = 0,070, p = 0,762) (Fig. 6F) e expressão de Fos em células aferentes pBLA IL (rs = 0,122, p = 0,597) e recuperação de extinção (Fig. 6H).
Diferenças individuais na reprodução da extinção não foram mapeadas para diferenças na expressão de Fos na amígdala basolateral.(A) Não houve diferenças significativas entre grupos na expressão de Fos em mBLA.(B) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recuperação da extinção no mBLA.(C) A expressão de Fos em células aferentes de IL mBLA não diferiu significativamente entre os grupos.(D) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em células aferentes de IL e a recuperação da extinção em mBLA.(E) Não houve diferenças significativas entre grupos na expressão de Fos em pBLA.(F) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recuperação da extinção em pBLA.(G) A expressão de Fos em células IL pBLA aferentes não diferiu significativamente entre os grupos.(H) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em células aferentes de IL e a recuperação da extinção em pBLA.As barras de erro representam o desvio padrão da média.
Finalmente, a atividade Fos global e específica da projeção IL foi analisada em mvHPC e pvHPC em todos os ratos. Houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, lembrança de medo e gaiola doméstica na expressão de Fos no mvHPC (X2 (3) = 8,056, p = 0,045), de modo que a boa extinção (Mean Rank Diff. = 13,29 , p = 0,031), mas nem a extinção pobre (Mean Rank Diff. = 6,857, p > 0,999) nem a lembrança de medo (Mean Rank Diff. = 8,000, p = 0,864) mostraram mais expressão de Fos do que o grupo de gaiolas domésticas (Fig. 7A). Houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, lembrança de medo e gaiola doméstica na expressão de Fos no mvHPC (X2 (3) = 8,056, p = 0,045), de modo que a boa extinção (Mean Rank Diff. = 13,29 , p = 0,031), mas nem a extinção pobre (Mean Rank Diff. = 6,857, p > 0,999) nem a lembrança de medo (Mean Rank Diff. = 8,000, p = 0,864) mostraram mais expressão de Fos do que o grupo de gaiolas domésticas (Fig. 7A). Между группами с хорошим угасанием, плохим угашением, отзывом страха и домашними клетками наблюдалась значительная разница в экспрессии Fos в mvHPC (X2 (3) = 8,056, p = 0,045), так что хорошее угасание (средняя ранговая разница = 13,29) , p = 0,031), но ни в группах с плохим угасанием (средняя ранговая разница = 6,857, p > 0,999), ни в группе с отзывом страха (средняя ранговая разница = 8,000, p = 0,864) экспрессия Fos была выше, чем в группе с домашней клеткой (рис. 7А). Houve uma diferença significativa na expressão de mvHPC Fos entre os grupos com extinção boa, extinção ruim, recordação de medo e células domésticas (X2(3) = 8,056, p = 0,045), extinção tão boa (diferença de classificação média = 13,29), p = 0,031), mas nem no grupo de extinção pobre (diferença de classificação média = 6,857, p > 0,999) nem no grupo de recordação de medo (diferença de classificação média = 8,000, p = 0,864) a expressão de Fos foi maior do que no grupo doméstico.célula (Fig. 7A). mvhpc 中 fos 表达 良好 消退 、 不良 消退 、 恐惧 和 家庭 笼组 笼组 之间 存在 差异 （x2 (3) = 8,056, p = 0,045） ， 因此 良好 消退 （平均 秩差 = 13,29 ） ， 但 无论是 （（秩差 = 6,857 ， p> 0,999） 还是 恐惧 （（平均 秩差 = 8.000 ， p = 0,864） 组都 显示 出 比 家庭 笼组 更 多 的 fos 表达 （图 2）。。 mvhpc 中 fos 表达 的 消退 、 不良 消退 恐惧 回忆 和 家庭 笼组 之间 存在 显着 差异 （（x2 (3) = 8.056, p = 0.045） ， 良好 （（平均 秩差 秩差 = 13.29） p = 0.031 ） ， 但 无论是 （（平均 秩差 秩差 = 6,857 ， p> 0,999） 还 是 （（平均 秩差 秩差 = 8.000 ， p = 0,864） 组 都 出 笼组 笼组 多 的 fos 表达 图 图） 。。。。 组 出 家庭 笼组 多 的 fos 表达 图 图 。。。。 ) Имелась значительная разница между группами «хорошо», «плохо», «припоминание страха» и «домашняя клетка» для экспрессии Fos в mvHPC (X2(3) = 8,056, p = 0,045) и, следовательно, хорошая регрессия (средняя разница рангов = 13,29), p = 0,031), но группы со слабым угасанием (средняя разница рангов = 6,857, p > 0,999) и воспоминания о страхе (средняя разница рангов = 8,000, p = 0,864) показали более высокую экспрессию Fos, чем группа в домашней клетке (рис. 2). Houve uma diferença significativa entre os grupos bom, ruim, recordação de medo e células domésticas para expressão de Fos em mvHPC (X2(3) = 8,056, p = 0,045) e, portanto, uma boa regressão (diferença média de classificação = 13,29), p = 0,031), mas grupos com extinção fraca (diferença média de classificação = 6,857, p > 0,999) e memórias de medo (diferença média de classificação = 8,000, p = 0,864) mostraram maior expressão de Fos do que o grupo em gaiola doméstica (Fig. 2).7A).No entanto, não houve diferença significativa (X2(3) = 4,893, p = 0,180) (Figura 7C).Além disso, não houve correlação significativa entre a expressão global de Fos em mvHPC (rs = -0,233, p = 0,309) (Figura 7B) e a expressão de Fos em células IL aferentes de mvHPC (rs = 0,056, p = 0,810) (Figura 7D).e um relatório sobre o desaparecimento.Além disso, não houve diferença significativa entre extinção boa, extinção ruim, lembrança de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em pvHPC (X2(3) = 3,623, p = 0,353) (Figura 7E) e não houve diferenças significativas.diferença na boa regressão da expressão de Fos em células IL aferentes pvHPC, regressão ruim, memória de medo e grupos de células domésticas (X2(3)=3,871, p=0,276) (Fig. 7G).Finalmente, não houve correlação significativa entre a expressão global de Fos pvHPC (rs = −0,127, p = 0,584) (Figura 7F) e a expressão de Fos em células pvHPC IL-aferentes (rs = 0,176, p = 0,447) e recuperação de extinção (Figura 7F ).7H).
A expressão de Fos é elevada no hipocampo ventral de ratos, indicando boa extinção da memória.(A) O grupo bem extinto, mas não os outros grupos, mostrou expressão aumentada de Fos em mvHPC em comparação com o grupo de células domésticas.(B) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recuperação da extinção no mvPHC.(C) A expressão de Fos em células IL aferentes mvHPC não diferiu significativamente entre os grupos.(D) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recuperação da extinção em mvHPC.(E) Não houve diferenças significativas entre os grupos na expressão de Fos em pvHPC.(F) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recuperação da extinção em pvHPC.(G) A expressão de Fos em células IL aferentes pVHPC não diferiu significativamente entre os grupos.(H) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recuperação da extinção em pvHPC.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05. *p < 0,05. *r < 0,05. *p < 0,05. *p < 0,05。 *p < 0,05。 *r < 0,05. *p < 0,05.Nossa análise primária para todas as regiões mostrou comparação em três níveis ao longo do eixo anteroposterior, embora também tenhamos analisado cada região que colapsou ao longo do eixo anteroposterior.Os resultados dessas análises são apresentados na tabela 1.
Aqui, testamos se as diferenças individuais na recordação da extinção seriam refletidas em diferentes padrões de atividade aferente no córtex límbico inferior.Para esse fim, avaliamos a atividade de Fos em projeções de IL do tálamo paraventricular, claustro, tonsila basolateral e hipocampo ventral após o replay da extinção.Nas células que projetam IL, encontramos maior atividade na região posterior do PVT em ratos que exibiram boa recuperação de extinção em comparação com ratos com extinção pobre.Não houve diferenças nos aferentes IL do núcleo clavicular, hipocampo ventral ou tonsila basolateral.Além das células que projetam IL, o aumento da atividade neural foi observado em áreas selecionadas do claustro de ratos e do hipocampo ventral com boa resolução.Nossos resultados indicam que a memória de extinção bem-sucedida é organizada por projeções específicas de PVT para IL e células não direcionadas a IL no claustro e no hipocampo ventral.
Descobrimos que a predição de PVT IL foi ativa em ratos que apresentaram boa recuperação de extinção, o que é consistente com um estudo recente mostrando que PVT é necessário para recuperação de extinção.Este estudo não usou manipulações específicas de sub-regiões, mas mostrou que ambas as projeções PVT na amígdala central lateral e projeções IL em PVT eram necessárias para reproduzir a extinção.Nossos resultados indicam que, além da cadeia IL-PVT-CeL, uma entrada pós-PVT em IL também pode ser necessária para a recuperação de extinção.Assim, verifica-se que ambas as conexões IL eferentes e aferentes estão envolvidas na reprodução da extinção.Um próximo passo importante é determinar o que faz com que o pPVT sinalize a reprodução da extinção no nível do circuito neural.Além da relação com IL, estudos anteriores de rastreamento de dutos31,32 mostraram que o pPVT recebe informações da substância cinzenta periaquedutal ventral (vPAG), que está associada ao aprendizado da extinção33,34,35,36.Embora o papel do vPAG na recuperação da extinção não tenha sido estabelecido, a predição do pPVT pelo vPAG é um candidato atraente devido à sua densidade e ao envolvimento de ambas as regiões na geração de evidências anteriores de extinção do medo.
Outro aspecto importante de nossos resultados PVT é que eles são especializados ao longo de seu eixo ântero-posterior.Surpreendentemente, a atividade neuronal da projeção PVT em IL se correlaciona com o estado comportamental oposto, de modo que a atividade de projeção pré-PVT em IL está associada à recordação do medo, enquanto a projeção pPVT é ativa após a extinção da recordação bem-sucedida (ou seja, medo).Esta heterogeneidade funcional dentro do PVT não é surpreendente dado o trabalho anterior [discutido em 37].Um exemplo notável de distribuição funcional em PVT surgiu recentemente em um estudo que caracterizou as propriedades de tipos específicos de células em PVT.Este estudo mostra que as células de dopamina que expressam DRD2 são predominantemente expressas em pPVT, inervam o córtex do membro anterior e respondem a estímulos aversivos.A segunda população celular é predominantemente expressa em aPVT e marca a transição para um estado de baixa excitação fisiológica e inerva o córtex dos membros inferiores.Nossos resultados dificilmente se encaixam nesse padrão, pois as células aPVT que projetam IL estão ativas durante a recordação do medo, enquanto as projeções pPVT estão ativas e os animais mostram baixos níveis de medo.Há pelo menos duas explicações possíveis para a aparente discrepância.Primeiro, os tipos de células identificados não estão localizados exclusivamente em um sítio ântero-posterior do TVV.Assim, células pPVT com projeção de IL ativas em ratos com boa memória de extinção podem pertencer a uma classe de células com maior probabilidade de serem detectadas em aPVT e sinalizar uma transição para um estado de baixa excitação.O mesmo pode ser verdade para células que projetam IL em aPVT ativado após memória de medo.Em segundo lugar, estudos de rastreamento anteriores identificaram a presença de pPVTs de projeção de IL3, embora alguns pareçam ser derivados de células contendo DRD2, outros tipos de células podem se projetar para IL e se tornarem ativados após a reprodução bem-sucedida da extinção.
Embora o objetivo deste estudo fosse identificar diferenças entre ratos exibindo diferentes fenótipos de extinção, esses experimentos também revelaram novos dados relacionados aos mecanismos de memória do medo.Curiosamente, encontramos aumento da atividade de Fos no CLA anterior em ratos com memória de medo.
A clavícula posiciona-se como o centro da comunicação cortical e está envolvida em processos que vão desde a integração sensorial até a atenção e o sono40,41,42,43.Há evidências limitadas sobre como o claustro está envolvido no condicionamento do medo ou na expressão do medo, no entanto, pesquisas anteriores mostraram que a expressão contextual do medo está envolvida na atividade de Fos no claustro.Foi relatado recentemente que a inibição das projeções de atresia para o córtex entorrinal durante o condicionamento de medo contextual prejudica a formação da memória de longo prazo, embora sua necessidade de expressão de medo não tenha sido testada.No mesmo estudo, o aumento da ativação de Fos foi observado quando os animais foram expostos a um novo ambiente em comparação com camundongos expostos a um ambiente familiar.Com isso em mente, a ativação do CLA que relatamos aqui pode ser devida à exposição à nova câmera durante o teste, e não ao medo do recall em si.Para caracterizar com mais precisão a função dos bloqueios no medo e no processamento situacional, estudos futuros devem usar a manipulação de bloqueio direcionada.
Embora trabalhos anteriores tenham demonstrado que a PVT está associada à expressão da memória do medo,45,46,47 não observamos nenhuma alteração na expressão total de Fos em ratos quando eles relembraram o medo 48 horas após o condicionamento.Essa diferença pode ser explicada por vários fatores, incluindo trabalhos anteriores testando o medo de pistas discretas no mesmo contexto em que o condicionamento ocorreu, enquanto em nosso experimento o teste foi feito em uma nova sala.Além disso, sacrificamos nossos animais 60 minutos após o teste, enquanto o trabalho anterior usava um ponto de tempo de 90 minutos.Finalmente, em estudos anteriores, o teste foi realizado em uma sala onde os animais poderiam responder com apetite, enquanto em nosso trabalho, os ratos foram testados sem resposta de apetite.Embora isso permita algum grau de inibição condicionada, há evidências de que permitir que os animais inibam a pressão para obter comida enquanto testam se eles têm medo cria um conflito motivacional (ou seja, medo versus recompensa), que é um fator estimulante chave.participação PVT48, 49. .
Sabe-se que a amígdala basolateral está envolvida na aquisição da extinção do medo50,51 e há evidências de que as projeções de BLA para IL também estejam envolvidas nesse processo23.No entanto, não está claro se o BLA e suas conexões estão envolvidos no retorno da extinção.Estudos de imagem23,28 mostraram aumento da atividade de BLA em animais recordando memórias desbotadas.Embora nosso trabalho anterior não tenha mostrado diferença na ativação do BLA entre ratos com boa e má extinção, nossos resultados aqui sugerem que a recuperação da extinção geralmente não afeta o BLA ou a ativação na previsão do BLA IL.Consistente com nossas descobertas, embora os estudos de manipulação de circuitos sugiram que as entradas de IL para o BLA são importantes para o aprendizado da extinção, elas não são necessárias para a recuperação da extinção.No entanto, o papel do BLA não pode ser completamente ignorado, pois evidências recentes sugerem que certos tipos de células no BLA são necessários para reproduzir a extinção.
Notavelmente, a lembrança do medo não resultou na ativação de Fos no BLA, pois estudos anteriores de lesões, drogas e imagens implicaram essa área na expressão do medo e/ou reconsolidação do medo após a recuperação54,55,56,57.Os dados apresentados aqui combinam os subnúcleos basal e lateral da amígdala, e dados anteriores sugerem que a expressão do medo impulsiona a atividade de Fos no lado dorsal do núcleo lateral.Analisamos os dados subjacentes e laterais separadamente, mas não houve diferença em nenhum dos casos (dados não mostrados) e ambas as áreas colapsaram nos dados que apresentamos aqui.Não analisamos sub-regiões da amígdala lateral, portanto alterações específicas nessa área podem ser mascaradas.Outra possibilidade de nenhuma mudança na atividade de Fos no BLA é devido ao tempo das memórias de medo em comparação com o condicionamento.Alguns trabalhos anteriores mostraram que a contribuição de BLA para a expressão de medo diminui com o tempo após o condicionamento, de modo que a expressão é dependente de BLA 24 horas após o condicionamento, mas independente em 7 dias (ref. 45, mas ver 58).ocorreu 48 horas após o treinamento, fazendo com que a falta de mudança na atividade de Fos neste ponto de tempo provavelmente reflita mudanças dependentes do tempo na participação do BLA na expressão do medo.
Finalmente, encontramos evidências de que a memória de extinção bem-sucedida está associada ao hipocampo ventral.Isso é característico de vHPCs “intermediários”, pois o mesmo padrão não foi observado na região posterior.Consistente com trabalhos anteriores, não encontramos alteração na ativação de Fos em ILs vHPC aferentes.Há evidências substanciais de que o vHPC28,60,61 é necessário para a atualização do medo quando o CS ocorre fora do contexto em que ocorre o desvanecimento e que isso depende, pelo menos em parte, da entrada do vHPC no IL13.Com base nesses resultados anteriores, esperaríamos que o desbotamento ruim estivesse associado ao aumento da atividade prevista de IL de vHPC.No entanto, este não foi o caso, pois não houve diferença na atividade de Fos em vHPCs marcados de forma retrógrada projetada com IL ou células não marcadas em vHPCs.Isso sugere que a incapacidade de lembrar o desaparecimento no contexto do desaparecimento pode desencadear um mecanismo diferente do medo da renovação.
É importante observar algumas das limitações inerentes de projeto e análise e como elas afetam nossas conclusões.Primeiro, dividimos os animais em terços superiores e inferiores, e camundongos em “bons” e “ruins” com base nas pontuações de recordação da extinção.Isso é feito para evitar esquemas de grupo que dividem animais em grupos separados do meio da distribuição, ou esquemas de grupo que excluem animais do meio da distribuição, como separação por mediana ou comparação dos terços superior e inferior de ratos .queremos evitar essa situação porque a divisão mediana não reflete a variabilidade das respostas humanas ao trauma que estamos tentando modelar.Além disso, enquanto comparar os terços superior e inferior de ratos nos permite comparar grupos de tamanho semelhante, essa abordagem ignora os animais no centro de distribuição e não reflete com precisão a variabilidade nas reações à lesão.Embora nosso método possa sofrer de problemas com variância heterogênea e comparação de grupos com tamanhos de amostra desiguais, ele captura o que estamos tentando imitar melhor do que os métodos alternativos.
Os resultados apresentados aqui nos ajudam a entender melhor como as diferenças individuais na recordação da extinção se refletem nas diferenças na atividade do circuito neural.Nossas descobertas podem ser relevantes para o transtorno de estresse pós-traumático, que é conhecido por estar associado ao medo excessivo e à incapacidade de eliminar as respostas de medo.Mostramos que as diferenças na recordação da extinção estão associadas a diferenças na atividade neural intrínseca e extrínseca projetada no IL.Essas diferenças foram distribuídas em regiões distintas ao longo do eixo anteroposterior, destacando ainda mais a importância de avaliar a função cerebral no nível sub-regional.As desvantagens do método atual incluem a relevância do estudo e o foco em roedores machos.Pesquisas futuras devem determinar os mecanismos neurobiológicos subjacentes ao aprendizado da extinção em roedores fêmeas e usar métodos para fazer inferências causais.
Os conjuntos de dados usados ​​e/ou analisados ​​no estudo atual estão disponíveis com os respectivos autores mediante solicitação razoável.
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