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Os vetores gênicos para o tratamento da fibrose cística pulmonar devem ser direcionados para as vias aéreas condutivas, uma vez que a transdução pulmonar periférica não tem efeito terapêutico.A eficiência da transdução viral está diretamente relacionada ao tempo de residência do portador.No entanto, os fluidos de entrega, como os portadores de genes, difundem-se naturalmente nos alvéolos durante a inalação e as partículas terapêuticas de qualquer forma são rapidamente removidas pelo transporte mucociliar.Estender o tempo de residência dos portadores de genes no trato respiratório é importante, mas difícil de conseguir.Partículas magnéticas conjugadas com portadores que podem ser direcionadas para a superfície do trato respiratório podem melhorar o direcionamento regional.Devido a problemas com imagens in vivo, o comportamento dessas pequenas partículas magnéticas na superfície das vias aéreas na presença de um campo magnético aplicado é pouco compreendido.O objetivo deste estudo foi usar a imagem síncrotron para visualizar in vivo o movimento de uma série de partículas magnéticas na traqueia de ratos anestesiados, a fim de estudar a dinâmica e os padrões de comportamento de partículas simples e em massa in vivo.Em seguida, também avaliamos se a entrega de partículas magnéticas lentivirais na presença de um campo magnético aumentaria a eficiência da transdução na traquéia do rato.A imagem de raios-X síncrotron mostra o comportamento de partículas magnéticas em campos magnéticos estacionários e em movimento in vitro e in vivo.As partículas não podem ser facilmente arrastadas pela superfície das vias aéreas vivas usando ímãs, mas durante o transporte, os depósitos se concentram no campo de visão, onde o campo magnético é mais forte.A eficiência da transdução também aumentou seis vezes quando as partículas magnéticas lentivirais foram entregues na presença de um campo magnético.Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que as partículas magnéticas lentivirais e os campos magnéticos podem ser abordagens valiosas para melhorar o direcionamento do vetor gênico e os níveis de transdução nas vias aéreas condutoras in vivo.
A fibrose cística (FC) é causada por variações em um único gene chamado regulador de condutância transmembrana CF (CFTR).A proteína CFTR é um canal iônico que está presente em muitas células epiteliais em todo o corpo, incluindo as vias aéreas, um local importante na patogênese da fibrose cística.Defeitos no CFTR levam ao transporte anormal de água, desidratação da superfície das vias aéreas e diminuição da profundidade da camada de fluido da superfície das vias aéreas (ASL).Também prejudica a capacidade do sistema de transporte mucociliar (MCT) de limpar as vias aéreas de partículas inaladas e patógenos.Nosso objetivo é desenvolver uma terapia genética lentiviral (LV) para entregar a cópia correta do gene CFTR e melhorar ASL, MCT e saúde pulmonar, e continuar desenvolvendo novas tecnologias que possam medir esses parâmetros in vivo1.
Os vetores LV são um dos principais candidatos à terapia gênica da fibrose cística, principalmente porque podem integrar permanentemente o gene terapêutico nas células basais das vias aéreas (células-tronco das vias aéreas).Isso é importante porque eles podem restaurar a hidratação normal e a depuração do muco, diferenciando-se em células funcionais da superfície das vias aéreas corrigidas por genes associadas à fibrose cística, resultando em benefícios ao longo da vida.Os vetores LV devem ser direcionados contra as vias aéreas condutoras, pois é aí que começa o envolvimento pulmonar na FC.A entrega do vetor mais profundamente no pulmão pode resultar em transdução alveolar, mas isso não tem efeito terapêutico na fibrose cística.No entanto, fluidos como portadores de genes migram naturalmente para os alvéolos quando inalados após o parto3,4 e as partículas terapêuticas são expelidas rapidamente para a cavidade oral pelos MCTs.A eficiência da transdução LV está diretamente relacionada ao tempo que o vetor permanece próximo às células-alvo para permitir a captação celular – “tempo de residência” 5 que é facilmente encurtado pelo fluxo de ar regional típico, bem como pela absorção coordenada de muco e partículas de MCT.Para a fibrose cística, a capacidade de prolongar o tempo de residência do VE nas vias aéreas é importante para atingir altos níveis de transdução nessa área, mas até agora tem sido um desafio.
Para superar esse obstáculo, propomos que as partículas magnéticas (MPs) de LV podem ajudar de duas maneiras complementares.Primeiro, eles podem ser guiados por um ímã até a superfície das vias aéreas para melhorar o direcionamento e ajudar as partículas portadoras de genes a estarem na área correta das vias aéreas;e ASL) movem-se para a camada celular 6. As MPs são amplamente utilizadas como veículos direcionados de entrega de drogas quando se ligam a anticorpos, drogas quimioterápicas ou outras moléculas pequenas que se ligam às membranas celulares ou se ligam aos seus respectivos receptores de superfície celular e se acumulam nos locais do tumor em presença de eletricidade estática.Campos magnéticos para terapia do câncer 7. Outros métodos “hipertérmicos” visam matar células tumorais aquecendo MPs quando expostas a campos magnéticos oscilantes.O princípio da transfecção magnética, no qual um campo magnético é usado como um agente de transfecção para aumentar a transferência de DNA para as células, é comumente usado in vitro usando uma variedade de vetores de genes virais e não virais para linhas celulares difíceis de transduzir ..A eficiência da magnetotransfecção LV com a entrega de MP LV in vitro em uma linha celular de epitélio brônquico humano na presença de um campo magnético estático foi estabelecida, aumentando a eficiência da transdução em 186 vezes em comparação com o vetor LV sozinho.O LV MT também foi aplicado a um modelo in vitro de fibrose cística, onde a transfecção magnética aumentou a transdução do VE em culturas de interface ar-líquido por um fator de 20 na presença de escarro de fibrose cística10.No entanto, a magnetotransfecção de órgão in vivo recebeu relativamente pouca atenção e foi avaliada apenas em alguns estudos com animais11,12,13,14,15, especialmente nos pulmões16,17.No entanto, as possibilidades de transfecção magnética na terapia pulmonar na fibrose cística são claras.Tan et ai.(2020) afirmou que “um estudo de validação sobre a entrega pulmonar eficaz de nanopartículas magnéticas abrirá o caminho para futuras estratégias de inalação de CFTR para melhorar os resultados clínicos em pacientes com fibrose cística”6.
O comportamento de pequenas partículas magnéticas na superfície do trato respiratório na presença de um campo magnético aplicado é difícil de visualizar e estudar e, portanto, são pouco compreendidos.Em outros estudos, desenvolvemos um método de imagem de raios-X de contraste de fase baseado em propagação síncrotron (PB-PCXI) para imagens não invasivas e quantificação de alterações in vivo mínimas na profundidade de ASL18 e no comportamento de MCT19,20 para medir diretamente a hidratação da superfície do canal de gás e é usado como um indicador precoce da eficácia do tratamento.Além disso, nosso método de pontuação MCT usa partículas de 10–35 µm de diâmetro compostas de alumina ou vidro de alto índice de refração como marcadores MCT visíveis com PB-PCXI21.Ambos os métodos são adequados para a geração de imagens de uma variedade de tipos de partículas, incluindo MPs.
Devido à alta resolução espacial e temporal, nossos ensaios ASL e MCT baseados em PB-PCXI são adequados para estudar a dinâmica e os padrões comportamentais de partículas individuais e em massa in vivo para nos ajudar a entender e otimizar os métodos de entrega de genes MP.A abordagem que usamos aqui é baseada em nossos estudos usando a linha de luz SPring-8 BL20B2, na qual visualizamos o movimento do fluido após a administração de uma dose de um vetor fictício nas vias aéreas nasais e pulmonares de camundongos para ajudar a explicar nossos padrões heterogêneos de expressão gênica observados em nosso gene.estudos em animais com uma dose portadora de 3,4 .
O objetivo deste estudo foi utilizar o síncrotron PB-PCXI para visualizar movimentos in vivo de uma série de MPs na traqueia de ratos vivos.Esses estudos de imagem PB-PCXI foram projetados para testar a série MP, a força do campo magnético e a localização para determinar seu efeito no movimento do MP.Assumimos que um campo magnético externo ajudaria o MF entregue a permanecer ou se mover para a área alvo.Esses estudos também nos permitiram determinar configurações de ímãs que maximizam a quantidade de partículas deixadas na traquéia após a deposição.Em uma segunda série de estudos, pretendemos usar essa configuração ideal para demonstrar o padrão de transdução resultante da entrega in vivo de LV-MPs às vias aéreas de ratos, assumindo que a entrega de LV-MPs no contexto do direcionamento das vias aéreas resultaria no aumento da eficiência da transdução do VE..
Todos os estudos em animais foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados pela Universidade de Adelaide (M-2019-060 e M-2020-022) e pelo Comitê de Ética de Animais Síncrotron SPring-8.Os experimentos foram conduzidos de acordo com as recomendações do ARRIVE.
Todas as imagens de raios X foram tiradas na linha de luz BL20XU no síncrotron SPring-8 no Japão usando uma configuração semelhante à descrita anteriormente21,22.Resumidamente, a caixa experimental foi localizada a 245 m do anel de armazenamento síncrotron.Uma distância amostra-detector de 0,6 m é usada para estudos de imagens de partículas e 0,3 m para estudos de imagens in vivo para criar efeitos de contraste de fase.Foi utilizado um feixe monocromático com energia de 25 keV.As imagens foram adquiridas usando um transdutor de raios X de alta resolução (SPring-8 BM3) acoplado a um detector sCMOS.O transdutor converte os raios X em luz visível usando um cintilador de 10 µm de espessura (Gd3Al2Ga3O12), que é então direcionado para o sensor sCMOS usando uma objetiva de microscópio ×10 (NA 0,3).O detector sCMOS foi um Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japão) com um tamanho de matriz de 2048 × 2048 pixels e um tamanho de pixel bruto de 6,5 × 6,5 µm.Essa configuração fornece um tamanho de pixel isotrópico efetivo de 0,51 µm e um campo de visão de aproximadamente 1,1 mm × 1,1 mm.A duração da exposição de 100 ms foi escolhida para maximizar a relação sinal-ruído das partículas magnéticas dentro e fora das vias aéreas, minimizando os artefatos de movimento causados ​​pela respiração.Para estudos in vivo, um obturador de raios-X rápido foi colocado no caminho dos raios-X para limitar a dose de radiação bloqueando o feixe de raios-X entre as exposições.
A mídia LV não foi usada em nenhum estudo de imagem SPring-8 PB-PCXI porque a câmara de imagem BL20XU não é certificada pelo Nível de Biossegurança 2.Em vez disso, selecionamos uma variedade de MPs bem caracterizados de dois fornecedores comerciais que cobrem uma variedade de tamanhos, materiais, concentrações de ferro e aplicações - primeiro para entender como os campos magnéticos afetam o movimento de MPs em capilares de vidro e, em seguida, em vias aéreas vivas.superfície.O tamanho do MP varia de 0,25 a 18 µm e é feito de vários materiais (ver Tabela 1), mas a composição de cada amostra, incluindo o tamanho das partículas magnéticas no MP, é desconhecida.Com base em nossos extensos estudos MCT 19, 20, 21, 23, 24, esperamos que PMs de até 5 µm possam ser vistos na superfície da via aérea traqueal, por exemplo, subtraindo quadros consecutivos para ver melhor visibilidade do movimento do MP.Um único MP de 0,25 µm é menor que a resolução do dispositivo de imagem, mas espera-se que o PB-PCXI detecte seu contraste volumétrico e o movimento do líquido da superfície na qual eles são depositados após serem depositados.
Amostras para cada MP na tabela.1 foi preparado em capilares de vidro de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EUA) com diâmetro interno de 0,63 mm.As partículas corpusculares estão disponíveis na água, enquanto as partículas CombiMag estão disponíveis no líquido proprietário do fabricante.Cada tubo é meio cheio com líquido (aproximadamente 11 µl) e colocado no porta-amostras (ver Figura 1).Os capilares de vidro foram colocados horizontalmente na platina na câmara de imagem, respectivamente, e posicionados nas bordas do líquido.Um ímã de níquel de 19 mm de diâmetro (28 mm de comprimento) feito de terra rara, neodímio, ferro e boro (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Austrália) com uma remanência de 1,17 T foi anexado a um mesa de transferência separada para conseguir alterar remotamente sua posição durante a renderização.A geração de imagens de raios X começa quando o ímã é posicionado aproximadamente 30 mm acima da amostra e as imagens são adquiridas a 4 quadros por segundo.Durante a geração de imagens, o ímã foi aproximado do tubo capilar de vidro (a uma distância de cerca de 1 mm) e então movido ao longo do tubo para avaliar o efeito da intensidade do campo e da posição.
Uma configuração de imagem in vitro contendo amostras de MP em capilares de vidro no estágio de translação da amostra xy.O caminho do feixe de raios X é marcado com uma linha pontilhada vermelha.
Uma vez estabelecida a visibilidade in vitro de MPs, um subconjunto deles foi testado in vivo em ratos Wistar albinos fêmeas selvagens (~12 semanas de idade, ~200 g).Medetomidina 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japão), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japão) e butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Os ratos foram anestesiados com a mistura Pharma (Japão) por injeção intraperitoneal.Após a anestesia, eles foram preparados para a imagem removendo a pele ao redor da traqueia, inserindo um tubo endotraqueal (ET; cânula intravenosa de 16 Ga, Terumo BCT) e imobilizando-os na posição supina em uma placa de imagem personalizada contendo uma bolsa térmica para manter a temperatura corporal.22. A placa de imagem foi então anexada ao estágio de amostra na caixa de imagem em um pequeno ângulo para alinhar a traquéia horizontalmente na imagem de raio-x, conforme mostrado na Figura 2a.
(a) Configuração de imagem in vivo na unidade de imagem SPring-8, caminho do feixe de raios-X marcado com linha pontilhada vermelha.(b,c) A localização do ímã traqueal foi realizada remotamente usando duas câmeras IP montadas ortogonalmente.No lado esquerdo da imagem na tela, você pode ver a alça de arame segurando a cabeça e a cânula de entrega instalada dentro do tubo ET.
Um sistema de bomba de seringa controlado remotamente (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) usando uma seringa de vidro de 100 µl foi conectado a um tubo PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) usando uma agulha de 30 Ga.Marque o tubo para garantir que a ponta esteja na posição correta na traqueia ao inserir o tubo endotraqueal.Com uma microbomba, o êmbolo da seringa foi retirado e a ponta do tubo foi imersa na amostra de MP a ser entregue.O tubo de entrega carregado foi então inserido no tubo endotraqueal, colocando a ponta na parte mais forte do nosso campo magnético aplicado esperado.A aquisição da imagem foi controlada usando um detector de respiração conectado à nossa caixa de temporização baseada em Arduino, e todos os sinais (por exemplo, temperatura, respiração, abertura/fechamento do obturador e aquisição de imagem) foram registrados usando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Austrália) 22 Ao obter imagens Quando o invólucro não estava disponível, duas câmeras IP (Panasonic BB-SC382) foram posicionadas a aproximadamente 90° uma da outra e usadas para controlar a posição do ímã em relação à traqueia durante a geração de imagens (Figura 2b, c).Para minimizar os artefatos de movimento, uma imagem por respiração foi adquirida durante o platô do fluxo respiratório terminal.
O ímã é anexado ao segundo estágio, que pode estar localizado remotamente na parte externa do corpo de imagem.Várias posições e configurações do ímã foram testadas, incluindo: colocado em um ângulo de aproximadamente 30° acima da traquéia (as configurações são mostradas nas Figuras 2a e 3a);um imã acima do animal e outro abaixo, com os pólos ajustados para atração (Figura 3b)., um ímã acima do animal e outro abaixo, com os pólos ajustados para repulsão (Figura 3c), e um ímã acima e perpendicular à traquéia (Figura 3d).Depois de configurar o animal e o ímã e carregar o MP em teste na bomba de seringa, administre uma dose de 50 µl a uma taxa de 4 µl/s após a aquisição das imagens.O ímã é então movido para frente e para trás ao longo ou através da traquéia enquanto continua a adquirir imagens.
Configuração do ímã para imagens in vivo (a) um ímã acima da traqueia em um ângulo de aproximadamente 30°, (b) dois ímãs configurados para atração, (c) dois ímãs configurados para repulsão, (d) um ímã acima e perpendicular à traquéia.O observador olhou da boca para os pulmões através da traquéia e o feixe de raios X passou pelo lado esquerdo do rato e saiu pelo lado direito.O ímã é movido ao longo do comprimento da via aérea ou à esquerda e à direita acima da traqueia na direção do feixe de raios-X.
Também procuramos determinar a visibilidade e o comportamento das partículas nas vias aéreas na ausência de mistura de respiração e frequência cardíaca.Portanto, no final do período de imagem, os animais foram sacrificados humanamente devido à overdose de pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, EUA; ~ 65 mg/kg ip).Alguns animais foram deixados na plataforma de imagem e, após cessar a respiração e os batimentos cardíacos, o processo de imagem foi repetido, adicionando uma dose adicional de MP se nenhum MP fosse visível na superfície das vias aéreas.
As imagens resultantes foram corrigidas para campo plano e escuro e depois montadas em um filme (20 quadros por segundo; 15–25 × velocidade normal, dependendo da frequência respiratória) usando um script personalizado escrito em MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Todos os estudos sobre a entrega de vetores de genes LV foram conduzidos no Centro de Pesquisa Animal de Laboratório da Universidade de Adelaide e visaram usar os resultados do experimento SPring-8 para avaliar se a entrega de LV-MP na presença de um campo magnético poderia aumentar a transferência de genes in vivo .Para avaliar os efeitos do MF e do campo magnético, dois grupos de animais foram tratados: um grupo foi injetado com LV MF com colocação de ímã e o outro grupo foi injetado com um grupo controle com LV MF sem ímã.
Os vetores do gene LV foram gerados usando métodos previamente descritos 25, 26 .O vetor LacZ expressa um gene de beta-galactosidase localizado no núcleo dirigido pelo promotor constitutivo MPSV (LV-LacZ), que produz um produto de reação azul em células transduzidas, visível em frentes e seções de tecido pulmonar.A titulação foi realizada em culturas de células contando manualmente o número de células LacZ-positivas usando um hemocitômetro para calcular o título em TU/ml.Os transportadores são criopreservados a -80°C, descongelados antes do uso e ligados ao CombiMag misturando 1:1 e incubando no gelo por pelo menos 30 minutos antes da entrega.
Ratos Sprague Dawley normais (n = 3/grupo, ~2-3 anestesiados ip com uma mistura de 0,4mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Austrália) e 60mg/kg de cetamina (Ilium, Austrália) com 1 mês de idade) ip ) e canulação oral não cirúrgica com uma cânula intravenosa de 16 Ga.Para garantir que o tecido da via aérea traqueal receba a transdução LV, ele foi condicionado usando nosso protocolo de perturbação mecânica descrito anteriormente, no qual a superfície da via aérea traqueal foi esfregada axialmente com uma cesta de arame (N-Circle, extrator de pedra de nitinol sem ponta NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, EUA) 30 p28.Então, cerca de 10 minutos após a perturbação na cabine de biossegurança, foi realizada a administração traqueal de LV-MP.
O campo magnético usado neste experimento foi configurado de forma semelhante a um estudo de raios-x in vivo, com os mesmos ímãs mantidos sobre a traquéia com pinças de stent de destilação (Figura 4).Um volume de 50 µl (alíquotas de 2 x 25 µl) de LV-MP foi entregue à traquéia (n = 3 animais) usando uma pipeta com ponta de gel, conforme descrito anteriormente.O grupo controle (n = 3 animais) recebeu o mesmo LV-MP sem o uso de ímã.Após o término da infusão, a cânula é retirada do tubo endotraqueal e o animal é extubado.O ímã permanece no local por 10 minutos antes de ser removido.Os ratos receberam uma dose subcutânea de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Austrália), seguido de retirada da anestesia por injeção intraperitoneal de 1 mg/kg de cloridrato de atipamazole (Antisedan, Zoetis, Austrália).Os ratos foram mantidos aquecidos e observados até a recuperação completa da anestesia.
Dispositivo de entrega LV-MP em uma cabine de segurança biológica.Você pode ver que a manga Luer-lock cinza claro do tubo ET se projeta da boca, e a ponta da pipeta de gel mostrada na figura é inserida através do tubo ET até a profundidade desejada na traquéia.
Uma semana após o procedimento de administração de LV-MP, os animais foram sacrificados humanamente por inalação de 100% de CO2 e a expressão de LacZ foi avaliada usando nosso tratamento X-gal padrão.Os três anéis de cartilagem mais caudais foram removidos para garantir que qualquer dano mecânico ou retenção de fluido devido à colocação do tubo endotraqueal não fosse incluído na análise.Cada traquéia foi cortada longitudinalmente para obter duas metades para análise e colocadas em um copo contendo borracha de silicone (Sylgard, Dow Inc) usando uma agulha Minutien (Fine Science Tools) para visualizar a superfície luminal.A distribuição e o caráter das células transduzidas foram confirmados por fotografia frontal usando um microscópio Nikon (SMZ1500) com uma câmera DigiLite e software TCapture (Tucsen Photonics, China).As imagens foram adquiridas com ampliação de 20x (incluindo a configuração máxima para toda a largura da traqueia), com todo o comprimento da traqueia exibido passo a passo, proporcionando sobreposição suficiente entre cada imagem para permitir que as imagens sejam “costuradas”.As imagens de cada traquéia foram então combinadas em uma única imagem composta usando o Composite Image Editor versão 2.0.3 (Microsoft Research) usando o algoritmo de movimento planar. A área de expressão LacZ dentro das imagens compostas traqueais de cada animal foi quantificada usando um script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) conforme descrito anteriormente28, usando configurações de 0,35 < Hue < 0,58, Saturação > 0,15 e Valor < 0,7. A área de expressão LacZ nas imagens compostas traqueais de cada animal foi quantificada usando um script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) conforme descrito anteriormente28, usando configurações de 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 e Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. A área de expressão LacZ em imagens traqueais compostas de cada animal foi quantificada usando um script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) conforme descrito anteriormente28 usando configurações de 0,350,15 e valor <0,7.如 述 ， 使用 自动 matlab 脚本 （r2020a ， Mathworks） 对 来自 每 动物 动物 的 气管 复合 图像 的 lacz 表达 区域 进行 量化 ， 使用 0,35 <色调 <0,58 、 饱和度 0,15 和值 <7 的。。。。。。。如 述 ， 自动 自动 matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 只 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 表达 量化 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、 0,15 和值 <0,7 的 。。。。。 .................... QUADRIL Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Áreas de expressão LacZ em imagens compostas da traquéia de cada animal foram quantificadas usando um script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) conforme descrito anteriormente usando configurações de 0,35 < matiz < 0,58, saturação > 0,15 e valor < 0,7.Ao rastrear os contornos do tecido no GIMP v2.10.24, uma máscara foi criada manualmente para cada imagem composta para identificar a área do tecido e evitar detecções falsas fora do tecido traqueal.As áreas coradas de todas as imagens compostas de cada animal foram somadas para dar a área total corada para aquele animal.A área pintada foi então dividida pela área total da máscara para obter uma área normalizada.
Cada traquéia foi embebida em parafina e seccionada com 5 µm de espessura.As seções foram contrastadas com vermelho rápido neutro por 5 minutos e as imagens foram adquiridas usando um microscópio Nikon Eclipse E400, câmera DS-Fi3 e software de captura de elementos NIS (versão 5.20.00).
Todas as análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).A significância estatística foi estabelecida em p ≤ 0,05.A normalidade foi testada usando o teste Shapiro-Wilk e as diferenças na coloração LacZ foram avaliadas usando um teste t não pareado.
As seis MPs descritas na Tabela 1 foram examinadas pelo PCXI, e a visibilidade está descrita na Tabela 2. Duas MPs de poliestireno (MP1 e MP2; 18 µm e 0,25 µm, respectivamente) não foram visíveis pelo PCXI, mas as amostras restantes puderam ser identificadas (exemplos são mostrados na Figura 5).MP3 e MP4 são pouco visíveis (10-15% Fe3O4; 0,25 µm e 0,9 µm, respectivamente).Embora o MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) contenha algumas das menores partículas testadas, foi o mais pronunciado.O produto CombiMag MP6 é difícil de distinguir.Em todos os casos, nossa capacidade de detectar MFs foi bastante aprimorada ao mover o ímã para frente e para trás paralelamente ao capilar.À medida que os ímãs se afastavam do capilar, as partículas eram puxadas para fora em longas cadeias, mas conforme os ímãs se aproximavam e a intensidade do campo magnético aumentava, as cadeias de partículas encurtavam à medida que as partículas migravam em direção à superfície superior do capilar (consulte o Vídeo Suplementar S1 : MP4), aumentando a densidade de partículas na superfície.Por outro lado, quando o ímã é removido do capilar, a intensidade do campo diminui e os MPs se reorganizam em longas cadeias que se estendem da superfície superior do capilar (consulte o Vídeo complementar S2: MP4).Depois que o ímã para de se mover, as partículas continuam a se mover por algum tempo depois de atingir a posição de equilíbrio.À medida que o MP se aproxima e se afasta da superfície superior do capilar, as partículas magnéticas tendem a atrair detritos através do líquido.
A visibilidade do MP no PCXI varia consideravelmente entre as amostras.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.Todas as imagens mostradas aqui foram tiradas com um imã posicionado aproximadamente 10 mm diretamente acima do capilar.Os grandes círculos aparentes são bolhas de ar presas nos capilares, mostrando claramente as características de borda preta e branca da imagem de contraste de fase.A caixa vermelha indica a ampliação que aumenta o contraste.Observe que os diâmetros dos circuitos magnéticos em todas as figuras não estão em escala e são aproximadamente 100 vezes maiores do que o mostrado.
À medida que o ímã se move para a esquerda e para a direita ao longo do topo do capilar, o ângulo da corda MP muda para se alinhar com o ímã (consulte a Figura 6), delineando assim as linhas do campo magnético.Para MP3-5, depois que a corda atinge o ângulo limite, as partículas se arrastam ao longo da superfície superior do capilar.Isso geralmente resulta em agrupamentos de MPs em grupos maiores perto de onde o campo magnético é mais forte (consulte o Vídeo Suplementar S3: MP5).Isso também é especialmente evidente ao gerar imagens próximas ao final do capilar, o que faz com que o MP se agregue e se concentre na interface líquido-ar.As partículas no MP6, que eram mais difíceis de distinguir do que as do MP3-5, não se arrastavam quando o ímã se movia ao longo do capilar, mas as cordas do MP se dissociavam, deixando as partículas à vista (consulte o vídeo complementar S4: MP6).Em alguns casos, quando o campo magnético aplicado foi reduzido movendo o ímã para uma longa distância do local da imagem, quaisquer MPs restantes desciam lentamente para a superfície inferior do tubo por gravidade, permanecendo na corda (consulte o Vídeo Suplementar S5: MP3) .
O ângulo da corda MP muda conforme o ímã se move para a direita acima do capilar.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.A caixa vermelha indica a ampliação que aumenta o contraste.Observe que os vídeos adicionais são para fins informativos, pois revelam importantes estruturas de partículas e informações dinâmicas que não podem ser visualizadas nessas imagens estáticas.
Nossos testes mostraram que mover o ímã para frente e para trás lentamente ao longo da traquéia facilita a visualização do MF no contexto do movimento complexo in vivo.Nenhum teste in vivo foi realizado porque os grânulos de poliestireno (MP1 e MP2) não eram visíveis no capilar.Cada um dos quatro MFs restantes foi testado in vivo com o longo eixo do ímã posicionado sobre a traquéia em um ângulo de cerca de 30° com a vertical (ver Figuras 2b e 3a), pois isso resultou em cadeias MF mais longas e foi mais eficaz do que um ímã..configuração encerrada.MP3, MP4 e MP6 não foram encontrados na traquéia de nenhum animal vivo.Ao visualizar o trato respiratório de ratos após a morte humana dos animais, as partículas permaneceram invisíveis mesmo quando um volume adicional foi adicionado com uma bomba de seringa.O MP5 tinha o maior teor de óxido de ferro e era a única partícula visível, por isso foi usado para avaliar e caracterizar o comportamento do MP in vivo.
A colocação do ímã sobre a traqueia durante a inserção do MF resultou em muitos, mas não todos, MFs concentrados no campo de visão.A entrada traqueal de partículas é melhor observada em animais sacrificados humanamente.Figura 7 e vídeo complementar S6: MP5 mostra captura magnética rápida e alinhamento de partículas na superfície da traqueia ventral, indicando que os MPs podem ser direcionados para áreas desejadas da traqueia.Ao pesquisar mais distalmente ao longo da traquéia após a entrega do MF, alguns MFs foram encontrados mais próximos da carina, o que indica força de campo magnético insuficiente para coletar e manter todos os MFs, uma vez que foram entregues na região de força máxima do campo magnético durante a administração de fluidos.processo.No entanto, as concentrações de MP pós-natal foram maiores ao redor da área da imagem, sugerindo que muitos MPs permaneceram nas regiões das vias aéreas onde a intensidade do campo magnético aplicado foi maior.
Imagens de (a) antes e (b) após a entrega de MP5 na traquéia de um rato recentemente sacrificado com um ímã colocado logo acima da área de imagem.A área representada está localizada entre dois anéis cartilaginosos.Há algum líquido nas vias aéreas antes que o MP seja aplicado.A caixa vermelha indica a ampliação que aumenta o contraste.Estas imagens são tiradas do vídeo apresentado no S6: MP5 Supplementary Video.
Mover o ímã ao longo da traqueia in vivo resultou em uma mudança no ângulo da cadeia MP na superfície das vias aéreas, semelhante à observada nos capilares (ver Figura 8 e Vídeo Suplementar S7: MP5).No entanto, em nosso estudo, as MPs não puderam ser arrastadas ao longo da superfície das vias respiratórias vivas, como os capilares.Em alguns casos, a cadeia MP aumenta conforme o ímã se move para a esquerda e para a direita.Curiosamente, também descobrimos que a cadeia de partículas muda a profundidade da camada superficial do fluido quando o ímã é movido longitudinalmente ao longo da traquéia e se expande quando o ímã é movido diretamente acima da cabeça e a cadeia de partículas é girada para uma posição vertical (consulte Vídeo Suplementar S7).: MP5 em 0:09, canto inferior direito).O padrão de movimento característico mudou quando o ímã foi movido lateralmente ao longo do topo da traqueia (ou seja, para a esquerda ou direita do animal, em vez de ao longo do comprimento da traqueia).As partículas ainda eram claramente visíveis durante seu movimento, mas quando o ímã foi removido da traquéia, as pontas dos fios de partículas tornaram-se visíveis (veja o Vídeo Suplementar S8: MP5, começando em 0:08).Isso está de acordo com o comportamento observado do campo magnético sob a ação de um campo magnético aplicado em um capilar de vidro.
Imagens de amostra mostrando MP5 na traquéia de um rato anestesiado ao vivo.(a) O ímã é usado para adquirir imagens acima e à esquerda da traqueia, então (b) depois de mover o ímã para a direita.A caixa vermelha indica a ampliação que aumenta o contraste.Estas imagens são do vídeo apresentado no Vídeo Suplementar do S7: MP5.
Quando os dois pólos foram sintonizados na orientação norte-sul acima e abaixo da traqueia (ou seja, atraindo; Fig. 3b), as cordas MP pareciam mais longas e estavam localizadas na parede lateral da traqueia, em vez da superfície dorsal da traquéia (ver Apêndice).Vídeo S9:MP5).No entanto, altas concentrações de partículas em um local (ou seja, a superfície dorsal da traqueia) não foram detectadas após a administração de fluidos usando um dispositivo de ímã duplo, o que geralmente ocorre com um dispositivo de ímã único.Então, quando um ímã foi configurado para repelir pólos opostos (Figura 3c), o número de partículas visíveis no campo de visão não aumentou após a entrega.A configuração de ambas as configurações de dois ímãs é desafiadora devido à alta intensidade do campo magnético que atrai ou empurra os ímãs, respectivamente.A configuração foi então alterada para um único ímã paralelo às vias aéreas, mas passando pelas vias aéreas em um ângulo de 90 graus, de modo que as linhas de força cruzassem a parede traqueal ortogonalmente (Figura 3d), uma orientação destinada a determinar a possibilidade de agregação de partículas em a parede lateral.ser observado.No entanto, nesta configuração, não houve movimento de acumulação de MF identificável ou movimento do ímã.Com base em todos esses resultados, uma configuração com um único ímã e uma orientação de 30 graus foi escolhida para estudos in vivo de portadores de genes (Fig. 3a).
Quando o animal foi fotografado várias vezes imediatamente após ser sacrificado humanamente, a ausência de movimento de tecido interferente significava que linhas de partículas mais finas e mais curtas podiam ser discernidas no claro campo intercartilaginoso, 'balançando' de acordo com o movimento de translação do ímã.ver claramente a presença e movimento de partículas MP6.
O título de LV-LacZ foi de 1,8 x 108 UI/mL e, após misturar 1:1 com CombiMag MP (MP6), os animais foram injetados com 50 µl de uma dose traqueal de 9 x 107 UI/ml de veículo LV (ou seja, 4,5 x 106 TU/rato).).).Nesses estudos, em vez de mover o ímã durante o trabalho de parto, fixamos o ímã em uma posição para determinar se a transdução VE poderia (a) ser melhorada em comparação com a administração vetorial na ausência de um campo magnético e (b) se a via aérea poderia estar focado.As células sendo transduzidas nas áreas-alvo magnéticas do trato respiratório superior.
A presença de ímãs e o uso de CombiMag em combinação com vetores LV não parecem afetar adversamente a saúde animal, assim como nosso protocolo padrão de entrega de vetores LV.As imagens frontais da região traqueal submetida à perturbação mecânica (Fig. 1 complementar) mostraram que o grupo tratado com LV-MP apresentou níveis significativamente mais altos de transdução na presença de um ímã (Fig. 9a).Apenas uma pequena quantidade de coloração azul LacZ estava presente no grupo de controle (Figura 9b).A quantificação de regiões normalizadas coradas com X-Gal mostrou que a administração de LV-MP na presença de um campo magnético resultou em uma melhora de aproximadamente 6 vezes (Fig. 9c).
Exemplo de imagens compostas mostrando transdução traqueal com LV-MP (a) na presença de um campo magnético e (b) na ausência de um ímã.(c) Melhora estatisticamente significativa na área normalizada de transdução LacZ na traqueia com o uso de um ímã (*p = 0,029, teste t, n = 3 por grupo, média ± erro padrão da média).
As seções coradas com vermelho rápido neutro (exemplo mostrado na Fig. 2 complementar) indicaram que as células coradas com LacZ estavam presentes na mesma amostra e no mesmo local relatado anteriormente.
O principal desafio na terapia gênica das vias aéreas continua sendo a localização precisa de partículas transportadoras em áreas de interesse e a obtenção de um alto nível de eficiência de transdução no pulmão móvel na presença de fluxo de ar e depuração ativa de muco.Para portadores de LV destinados ao tratamento de doenças respiratórias na fibrose cística, aumentar o tempo de residência das partículas transportadoras nas vias aéreas condutoras tem sido até agora um objetivo inatingível.Conforme apontado por Castellani et al., o uso de campos magnéticos para aumentar a transdução tem vantagens sobre outros métodos de entrega de genes, como a eletroporação, porque pode combinar simplicidade, economia, entrega localizada, maior eficiência e menor tempo de incubação.e possivelmente uma dose menor de veículo10.No entanto, a deposição in vivo e o comportamento de partículas magnéticas nas vias aéreas sob a influência de forças magnéticas externas nunca foram descritos e, de fato, a capacidade desse método de aumentar os níveis de expressão gênica em vias aéreas vivas intactas não foi demonstrada in vivo.
Nossos experimentos in vitro no síncrotron PCXI mostraram que todas as partículas que testamos, com exceção do poliestireno MP, eram visíveis na configuração de imagem que usamos.Na presença de um campo magnético, os campos magnéticos formam cordas, cujo comprimento está relacionado ao tipo de partícula e à força do campo magnético (ou seja, a proximidade e o movimento do ímã).Conforme mostrado na Figura 10, as cordas que observamos são formadas à medida que cada partícula individual torna-se magnetizada e induz seu próprio campo magnético local.Esses campos separados fazem com que outras partículas semelhantes se acumulem e se conectem com movimentos de cordas de grupo devido a forças locais das forças locais de atração e repulsão de outras partículas.
Diagrama mostrando (a, b) cadeias de partículas se formando dentro de capilares cheios de líquido e (c, d) uma traqueia cheia de ar.Observe que os capilares e a traquéia não estão desenhados em escala.O painel (a) também contém uma descrição do MF contendo partículas de Fe3O4 dispostas em cadeias.
Quando o ímã se moveu sobre o capilar, o ângulo da corda de partículas atingiu o limite crítico para MP3-5 contendo Fe3O4, após o que a corda de partículas não permaneceu mais em sua posição original, mas moveu-se ao longo da superfície para uma nova posição.magnético.Esse efeito provavelmente ocorre porque a superfície do capilar de vidro é lisa o suficiente para permitir que esse movimento ocorra.Curiosamente, o MP6 (CombiMag) não se comportou dessa maneira, talvez porque as partículas fossem menores, tivessem um revestimento ou carga de superfície diferente ou o fluido transportador proprietário afetasse sua capacidade de se mover.O contraste na imagem da partícula CombiMag também é mais fraco, sugerindo que o líquido e as partículas podem ter a mesma densidade e, portanto, não podem se mover facilmente um em direção ao outro.As partículas também podem ficar presas se o ímã se mover muito rápido, indicando que a força do campo magnético nem sempre pode superar o atrito entre as partículas no fluido, sugerindo que a força do campo magnético e a distância entre o ímã e a área alvo não devem vir como um obstáculo. surpresa.importante.Esses resultados também indicam que, embora os ímãs possam capturar muitas micropartículas que fluem através da área-alvo, é improvável que os ímãs sejam confiáveis ​​para mover as partículas CombiMag ao longo da superfície da traquéia.Assim, concluímos que os estudos in vivo LV MF devem usar campos magnéticos estáticos para atingir fisicamente áreas específicas da árvore das vias aéreas.
Depois que as partículas são entregues no corpo, elas são difíceis de identificar no contexto do complexo tecido em movimento do corpo, mas sua capacidade de detecção foi aprimorada ao mover o ímã horizontalmente sobre a traqueia para “agitar” as cordas MP.Embora a imagem em tempo real seja possível, é mais fácil discernir o movimento das partículas depois que o animal foi morto humanamente.As concentrações de MP eram geralmente mais altas neste local quando o ímã era posicionado sobre a área de imagem, embora algumas partículas fossem geralmente encontradas mais abaixo na traqueia.Ao contrário dos estudos in vitro, as partículas não podem ser arrastadas pela traquéia pelo movimento de um ímã.Esse achado é consistente com a forma como o muco que cobre a superfície da traqueia normalmente processa as partículas inaladas, prendendo-as no muco e, subsequentemente, limpando-as por meio do mecanismo de depuração mucociliar.
Nossa hipótese é que o uso de ímãs acima e abaixo da traquéia para atração (Fig. 3b) poderia resultar em um campo magnético mais uniforme, em vez de um campo magnético altamente concentrado em um ponto, potencialmente resultando em uma distribuição mais uniforme de partículas..No entanto, nosso estudo preliminar não encontrou evidências claras para apoiar essa hipótese.Da mesma forma, definir um par de ímãs para repulsão (Fig. 3c) não resultou em mais sedimentação de partículas na área da imagem.Essas duas descobertas demonstram que a configuração de ímã duplo não melhora significativamente o controle local do apontamento de MP e que as fortes forças magnéticas resultantes são difíceis de ajustar, tornando essa abordagem menos prática.Da mesma forma, orientar o ímã acima e através da traqueia (Figura 3d) também não aumentou o número de partículas restantes na área de imagem.Algumas dessas configurações alternativas podem não ser bem-sucedidas, pois resultam em uma redução na intensidade do campo magnético na zona de deposição.Assim, a configuração de ímã único a 30 graus (Fig. 3a) é considerada o método de teste in vivo mais simples e eficiente.
O estudo LV-MP mostrou que quando os vetores LV foram combinados com o CombiMag e entregues após serem fisicamente perturbados na presença de um campo magnético, os níveis de transdução aumentaram significativamente na traqueia em comparação com os controles.Com base em estudos de imagem síncrotron e resultados de LacZ, o campo magnético parece ser capaz de manter o VE na traqueia e reduzir o número de partículas vetoriais que imediatamente penetram profundamente no pulmão.Essas melhorias de direcionamento podem levar a uma maior eficiência, ao mesmo tempo em que reduzem títulos entregues, transdução não direcionada, efeitos colaterais inflamatórios e imunológicos e custos de transferência de genes.É importante ressaltar que, de acordo com o fabricante, o CombiMag pode ser usado em combinação com outros métodos de transferência de genes, incluindo outros vetores virais (como AAV) e ácidos nucléicos.