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Toxoplasma gondii é um protozoário parasita intracelular que modula o microambiente do hospedeiro infectado e é conhecido por estar associado à incidência de crescimento tumoral cerebral.Neste estudo, levantamos a hipótese de que o miRNA-21 exossomal da infecção por Toxoplasma promove o crescimento do tumor cerebral.Os exossomos da microglia BV2 infectada por Toxoplasma foram caracterizados e a internalização de células de glioma U87 foi confirmada.Perfis de expressão de microRNA exossomal foram analisados ​​usando arranjos de microRNA e microRNA-21A-5p associados a Toxoplasma gondii e classificação tumoral.Também investigamos os níveis de mRNA de genes associados a tumores em células de glioma U87 alterando os níveis de miR-21 em exossomos e o efeito dos exossomos na proliferação de células de glioma U87 humano.Em exossomos de células de glioma U87 infectadas com Toxoplasma gondii, a expressão do microRNA-21 é aumentada e a atividade de genes antitumorais (FoxO1, PTEN e PDCD4) é reduzida.Exossomos derivados de BV2 infectados com Toxoplasma induzem a proliferação de células de glioma U87.Exossomos induzem o crescimento de células U87 em um modelo de tumor de camundongo.Sugerimos que o aumento de miR-21 exossomal na microglia BV2 infectada por Toxoplasma pode desempenhar um papel importante como um promotor de crescimento celular em células de glioma U87, regulando negativamente genes antitumorais.
Estima-se que mais de 18,1 milhões de casos de câncer avançado foram diagnosticados em todo o mundo em 2018, com cerca de 297.000 tumores do sistema nervoso central diagnosticados a cada ano (1,6% de todos os tumores)1.Pesquisas anteriores mostraram que os fatores de risco para o desenvolvimento de tumores cerebrais humanos incluem vários produtos químicos, histórico familiar e radiação ionizante de equipamentos terapêuticos e de diagnóstico da cabeça.No entanto, a causa exata dessas malignidades é desconhecida.Aproximadamente 20% de todos os cânceres no mundo são causados ​​por agentes infecciosos, incluindo vírus, bactérias e parasitas3,4.Os patógenos infecciosos interrompem os mecanismos genéticos da célula hospedeira, como o reparo do DNA e o ciclo celular, e podem levar à inflamação crônica e danos ao sistema imunológico5.
Agentes infecciosos associados ao câncer humano são os patógenos virais mais comuns, incluindo papilomavírus humano e vírus da hepatite B e C.Os parasitas também podem desempenhar um papel potencial no desenvolvimento do câncer humano.Várias espécies de parasitas, nomeadamente Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis e Hymenolepis nana, têm sido implicadas em vários tipos de cancro humano 6,7,8.
Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular que regula o microambiente das células infectadas do hospedeiro.Estima-se que esse parasita infecte aproximadamente 30% da população mundial, colocando toda a população em risco9,10.O Toxoplasma gondii pode infectar órgãos vitais, incluindo o sistema nervoso central (SNC), e causar doenças graves, como meningite e encefalite fatais, principalmente em pacientes imunocomprometidos9.No entanto, o Toxoplasma gondii também pode alterar o ambiente do hospedeiro infectado modulando o crescimento celular e as respostas imunes em indivíduos imunocompetentes, levando à manutenção de uma infecção crônica assintomática9,11.Curiosamente, dada a correlação entre a prevalência de T. gondii e a incidência de tumor cerebral, alguns relatórios sugerem que as mudanças ambientais do hospedeiro in vivo devido à infecção crônica por T. gondii se assemelham ao microambiente do tumor.
Os exossomos são conhecidos como comunicadores intercelulares que fornecem conteúdo biológico, incluindo proteínas e ácidos nucléicos, de células vizinhas16,17.Os exossomos podem influenciar os processos biológicos relacionados ao tumor, como anti-apoptose, angiogênese e metástase no microambiente do tumor.Em particular, os miRNAs (miRNAs), pequenos RNAs não codificantes com cerca de 22 nucleotídeos de comprimento, são importantes reguladores de genes pós-transcricionais que controlam mais de 30% do mRNA humano através do complexo de silenciamento induzido por miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii pode interromper processos biológicos controlando a expressão de miRNA em hospedeiros infectados.Os miRNAs do hospedeiro contêm sinais importantes para regular os processos biológicos do hospedeiro para alcançar a estratégia de sobrevivência do parasita.Assim, estudar as mudanças no perfil do miRNA do hospedeiro durante a infecção pelo T. gondii pode nos ajudar a entender mais claramente a interação entre o hospedeiro e o T. gondii.De fato, Thirugnanam et al.15 sugeriram que o T. gondii promove a carcinogênese cerebral alterando sua expressão em miRNAs específicos do hospedeiro associados ao crescimento do tumor e descobriram que o T. gondii pode causar gliomas em animais experimentais.
Este estudo enfoca a alteração do miR-21 exossomal na micróglia hospedeira infectada com Toxoplasma BV2.Observamos um possível papel do miR-21 exossomal alterado no crescimento de células de glioma U87 devido à retenção no núcleo de FoxO1/p27, que é o alvo do miR-21 superexpresso.
Os exossomos derivados do BV2 foram obtidos por centrifugação diferencial e validados por vários métodos para prevenir a contaminação com componentes celulares ou outras vesículas.A eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrou padrões distintos entre proteínas extraídas de células BV2 e exossomos (Figura 1A), e as amostras foram avaliadas quanto à presença de Alix, que foi analisada por Western blotting de marcadores de proteínas exossomais em .A marcação de Alix foi encontrada em proteínas de exossomos, mas não em proteínas de lisado de células BV2 (Fig. 1B).Além disso, o RNA purificado de exossomos derivados de BV2 foi analisado usando um bioanalisador.As subunidades ribossomais 18S e 28S raramente foram observadas no padrão de migração de RNA exossomal, indicando pureza confiável (Figura 1C).Finalmente, a microscopia eletrônica de transmissão mostrou que os exossomos observados tinham cerca de 60-150 nm de tamanho e tinham uma estrutura em forma de taça típica da morfologia do exossomo (Fig. 1D).
Caracterização de exossomos derivados de células BV2.(A) Página da folha de dados de segurança.As proteínas foram isoladas de células BV2 ou exossomos derivados de BV2.Padrões de proteínas diferem entre células e exossomos.(B) Análise de Western blot de um marcador exossomal (Alix).(C) Avaliação de RNA purificado de células BV2 e exossomos derivados de BV2 usando um bioanalisador.Assim, as subunidades ribossomais 18S e 28S em células BV2 raramente foram encontradas no RNA exossomal.(D) A microscopia eletrônica de transmissão mostrou que os exossomos isolados das células BV2 foram corados negativamente com acetato de uranila a 2%.Os exossomos têm aproximadamente 60-150 nm de tamanho e formato de taça (Song e Jung, dados não publicados).
A internalização celular de exossomos derivados de BV2 em células de glioma humano U87 foi observada usando microscopia confocal.Os exossomas marcados com PKH26 estão localizados no citoplasma das células U87.Os núcleos foram corados com DAPI (Fig. 2A), indicando que os exossomos derivados de BV2 podem ser internalizados pelas células hospedeiras e influenciar o ambiente das células receptoras.
A internalização de exossomas derivados de BV2 em células de glioma U87 e exossomas derivados de BV2 infectados com Toxoplasma RH induziu a proliferação de células de glioma U87.(A) Exossomos englobados por células U87 medidos por microscopia confocal.Células de glioma U87 foram incubadas com exossomos marcados com PKH26 (vermelho) ou sem controle por 24 horas.Os núcleos foram corados com DAPI (azul) e observados em microscópio confocal (barra de escala: 10 μm, x 3000).(B) A proliferação de células de glioma U87 foi determinada pelo ensaio de proliferação celular.As células de glioma U87 foram tratadas com exossomas pelo tempo indicado. *P < 0,05 foi obtido pelo teste t de Student. *P < 0,05 foi obtido pelo teste t de Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 pelo teste t de Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtido pelo teste t de Student.
Depois de confirmar a internalização de exossomos derivados de BV2 em células de glioma U87, realizamos ensaios de proliferação celular para investigar o papel dos exossomos derivados de Toxoplasma derivados de BV2 no desenvolvimento de células de glioma humano.O tratamento de células U87 com exossomos de células BV2 infectadas com T. gondii mostrou que exossomos derivados de BV2 infectados com T. gondii causaram uma proliferação significativamente maior de células U87 em comparação com o controle (Fig. 2B).
Além disso, o crescimento de células U118 teve os mesmos resultados que U87, pois os exossomos estimulados por Toxoplasma causaram os níveis mais altos de proliferação (dados não mostrados).Com base nesses dados, podemos indicar que os exossomos infectados pelo Toxoplasma derivado do BV2 desempenham um papel importante na proliferação das células do glioma.
Para investigar o efeito de exossomos derivados de BV2 infectados por Toxoplasma no desenvolvimento do tumor, injetamos células de glioma U87 em camundongos nus para um modelo de xenoenxerto e injetamos exossomos derivados de BV2 ou exossomos derivados de BV2 infectados por RH.Depois que os tumores se tornaram aparentes após 1 semana, cada grupo experimental de 5 camundongos foi dividido de acordo com o tamanho do tumor para determinar o mesmo ponto de partida, e o tamanho do tumor foi medido por 22 dias.
Em camundongos com o modelo de xenoenxerto U87, tamanho e peso do tumor significativamente maiores foram observados no grupo de exossomos infectados com RH derivado de BV2 no dia 22 (Fig. 3A,B).Por outro lado, não houve diferença significativa no tamanho do tumor entre o grupo de exossomos derivados de BV2 e o grupo controle após o tratamento com exossomos.Além disso, camundongos injetados com células de glioma e exossomos exibiram visualmente o maior volume de tumor no grupo de exossomos derivados de BV2 infectados por RH (Fig. 3C).Estes resultados demonstram que os exossomos infectados com Toxoplasma derivados de BV2 induzem o crescimento de glioma em um modelo de tumor de camundongo.
Oncogênese (AC) de exossomos derivados de BV2 em um modelo de camundongo de xenoenxerto U87.O tamanho do tumor (A) e o peso (B) foram significativamente aumentados em camundongos nus BALB/c tratados com exossomos infectados por RH derivados de BV2.Camundongos nus BALB/c (C) foram injetados subcutaneamente com 1 x 107 células U87 suspensas em mistura Matrigel.Seis dias após a injeção, 100 μg de exossomos derivados de BV2 foram tratados em camundongos.O tamanho e o peso do tumor foram medidos nos dias indicados e após o sacrifício, respectivamente. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05。 *P < 0,05。 *Р < 0,05. *P < 0,05.
Os dados mostraram que 37 miRNAs (16 superexpressos e 21 subexpressos) associados à imunidade ou ao desenvolvimento tumoral foram significativamente alterados na micróglia após a infecção com a cepa Toxoplasma RH (Fig. 4A).Os níveis de expressão relativa de miR-21 entre miRNAs alterados foram confirmados por RT-PCR em tempo real em exossomos derivados de BV2, exossomas tratados com células BV2 e U87.A expressão de miR-21 mostrou um aumento significativo nos exossomos de células BV2 infectadas com Toxoplasma gondii (estirpe RH) (Fig. 4B).Os níveis de expressão relativa de miR-21 em células BV2 e U87 aumentaram após a absorção de exossomos alterados (Fig. 4B).Os níveis relativos de expressão de miR-21 nos tecidos cerebrais de pacientes com tumor e camundongos infectados com Toxoplasma gondii (estirpe ME49) foram maiores do que nos controles, respectivamente (Fig. 4C).Esses resultados se correlacionam com diferenças entre os níveis de expressão de microRNAs previstos e confirmados in vitro e in vivo.
Alterações na expressão de miP-21a-5p exossomal em micróglia infectada com Toxoplasma gondii (RH).(A) Demonstra alterações significativas no siRNA associadas à imunidade ou ao desenvolvimento do tumor após a infecção por T. gondii RH.(B) Os níveis relativos de expressão de miR-21 foram detectados por RT-PCR em tempo real em exossomas derivados de BV2, exossomas tratados com BV2 e células U87.(C) Níveis relativos de expressão de miR-21 foram encontrados nos tecidos cerebrais de pacientes com tumor (N=3) e camundongos infectados com Toxoplasma gondii (cepa ME49) (N=3). *P < 0,05 foi obtido pelo teste t de Student. *P < 0,05 foi obtido pelo teste t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 foi obtido pelo teste t de Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtido pelo teste t de Student.
Exossomos de células BV2 infectadas com RH levaram ao crescimento de gliomas in vivo e in vitro (Fig. 2, 3).Para detectar mRNAs relevantes, examinamos os níveis de mRNA de genes-alvo antitumorais, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN e morte celular programada 4 (PDCD4) em células U87 infectadas com exossomos derivados de BV2 ou RH BV2.A análise de bioinformática mostrou que vários genes associados a tumores, incluindo os genes FoxO1, PTEN e PDCD4, possuem sítios de ligação miR-2121,22.Os níveis de mRNA de genes alvo antitumorais foram reduzidos em exossomas derivados de BV2 infectados por RH em comparação com exossomas derivados de BV2 (Fig. 5A).FoxO1 mostrou níveis de proteína reduzidos em exossomas derivados de BV2 infectados por RH em comparação com exossomas derivados de BV2 (Figura 5B).Com base nesses resultados, pudemos confirmar que os exossomos derivados do BV2 infectado por RH regulam negativamente os genes anti-oncogênicos, mantendo seu papel no crescimento do tumor.
Exossomos derivados de BV2 infectados por Toxoplasma RH induzem a supressão de genes antitumorais em células de glioma U87 por exossomos derivados de BV2 infectados por Toxoplasma RH.(A) PCR em tempo real da expressão de FoxO1, PTEN e PDCD4 em exossomos derivados de BV2 infectado por T. gondii RH em comparação com exossomos de PBS.O mRNA de β-actina foi usado como controle.(B) A expressão de FoxO1 foi determinada por Western blotting e os dados de densitometria foram avaliados estatisticamente usando o programa ImageJ. *P < 0,05 foi obtido pelo teste t de Student. *P < 0,05 foi obtido pelo teste t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 foi obtido pelo teste t de Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtido pelo teste t de Student.
Para entender o efeito de miP-21 em exossomas na regulação do gene associado ao tumor, células U87 foram transfectadas com um inibidor de miP-21 usando Lipofectamine 2000 e as células foram colhidas 24 horas após a transfecção.Os níveis de expressão de FoxO1 e p27 em células transfectadas com inibidores de miR-21 foram comparados com células tratadas com exossomos derivados de BV2 usando qRT-PCR (Fig. 6A,B).A transfecção do inibidor de miR-21 em células U87 reduziu significativamente a expressão de FoxO1 e p27 (FIG. 6).
MiP-21 derivado de BV2 exossomal infectado por RH alterou a expressão de FoxO1/p27 em células de glioma U87.As células U87 foram transfectadas com inibidor de miP-21 usando Lipofectamine 2000 e as células foram colhidas 24 horas após a transfecção.Os níveis de expressão de FoxO1 e p27 em células transfectadas com inibidores de miR-21 foram comparados aos níveis em células tratadas com exossomos derivados de BV2 usando qRT-PCR (A, B).
Para escapar da resposta imune do hospedeiro, o parasita Toxoplasma se transforma em um cisto tecidual.Eles parasitam vários tecidos, incluindo cérebro, coração e músculo esquelético, durante toda a vida do hospedeiro e modulam a resposta imune do hospedeiro.Além disso, podem regular o ciclo celular e a apoptose das células hospedeiras, promovendo sua proliferação14,24.Toxoplasma gondii infecta predominantemente células dendríticas do hospedeiro, neutrófilos e linhagem de monócitos/macrófagos, incluindo microglia cerebral.Toxoplasma gondii induz a diferenciação de macrófagos do fenótipo M2, afeta a cicatrização de feridas após a infecção do patógeno e também está associado à hipervascularização e fibrose granulomatosa.Essa patogênese comportamental da infecção por Toxoplasma pode estar relacionada a marcadores associados ao desenvolvimento tumoral.O ambiente hostil regulado pelo Toxoplasma pode assemelhar-se ao pré-câncer correspondente.Portanto, pode-se supor que a infecção por Toxoplasma deve contribuir para o desenvolvimento de tumores cerebrais.De fato, altas taxas de infecção por Toxoplasma foram relatadas no soro de pacientes com vários tumores cerebrais.Além disso, o Toxoplasma gondii pode ser outro efetor carcinogênico e atuar sinergicamente para ajudar outros carcinógenos infecciosos a desenvolverem tumores cerebrais.A esse respeito, vale ressaltar que o P. falciparum e o vírus Epstein-Barr contribuem sinergicamente para a formação do linfoma de Burkitt.
O papel dos exossomos como reguladores no campo da pesquisa do câncer tem sido extensivamente investigado.No entanto, o papel dos exossomos entre parasitas e hospedeiros infectados permanece pouco compreendido.Até agora, vários reguladores, incluindo proteínas secretadas, explicaram os processos biológicos pelos quais os parasitas protozoários resistem ao ataque do hospedeiro e perpetuam a infecção.Recentemente, tem havido um conceito crescente de que microvesículas associadas a protozoários e seus microRNAs interagem com células hospedeiras para criar um ambiente favorável para sua sobrevivência.Portanto, mais estudos são necessários para descobrir a relação entre miRNAs exossomais alterados e proliferação de células de glioma.A alteração do microRNA (genes cluster miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 e miR-17-92) se liga ao promotor STAT3 em macrófagos humanos infectados por toxoplasma, é regulada e induz anti -apoptose em resposta à infecção por Toxoplasma gondii 29 .A infecção por toxoplasma aumenta a expressão de miR-17-5p e miR-106b-5p, que estão associados a várias doenças hiperproliferativas 30 .Esses dados sugerem que os miRNAs do hospedeiro regulados pela infecção por Toxoplasma são moléculas importantes para a sobrevivência do parasita e patogênese no comportamento biológico do hospedeiro.
MiRNAs alterados podem influenciar vários tipos de comportamento durante a iniciação e progressão de células malignas, incluindo gliomas: autossuficiência de sinais de crescimento, insensibilidade a sinais inibidores de crescimento, evasão de apoptose, potencial replicativo ilimitado, angiogênese, invasão e metástase e inflamação.No glioma, miRNAs alterados foram identificados em vários estudos de perfis de expressão.
No presente estudo, confirmamos altos níveis de expressão de miRNA-21 em células hospedeiras infectadas por toxoplasma.O miR-21 foi identificado como um dos microRNAs mais freqüentemente superexpressos em tumores sólidos, incluindo gliomas, 33 e sua expressão se correlaciona com o grau de glioma.Evidências acumuladas sugerem que o miR-21 é um novo oncogene que atua como um fator anti-apoptótico no crescimento de gliomas e é altamente expresso em tecidos e plasma de malignidades cerebrais humanas.Curiosamente, a inativação do miR-21 em células e tecidos de glioma desencadeia a inibição da proliferação celular devido à apoptose dependente de caspase.A análise bioinformática dos alvos previstos para miR-21 revelou múltiplos genes supressores de tumor associados a vias de apoptose, incluindo morte celular programada 4 (PDCD4), tropomiosina (TPM1), PTEN e forkhead box O1 (FoxO1), com o sítio de ligação miR-2121..22.38.
FoxO1, como um dos fatores de transcrição (FoxO), está envolvido no desenvolvimento de vários tipos de câncer humano e pode regular a expressão de genes supressores de tumor como p21, p27, Bim e FasL40.FoxO1 pode ligar e ativar inibidores do ciclo celular, como p27, para suprimir o crescimento celular.Além disso, FoxO1 é um efetor chave da sinalização de PI3K/Akt e regula muitos processos biológicos, como a progressão do ciclo celular e a diferenciação celular por meio da ativação da transcrição de p2742.
Em conclusão, acreditamos que o miR-21 exossomal derivado da micróglia infectada por Toxoplasma pode desempenhar um papel importante como regulador do crescimento de células de glioma (Fig. 7).No entanto, mais estudos são necessários para encontrar uma ligação direta entre miR-21 exossomal, infecção alterada por Toxoplasma e crescimento de glioma.Espera-se que esses resultados forneçam um ponto de partida para estudar a relação entre a infecção por Toxoplasma e a incidência de glioma.
Um diagrama esquemático do mecanismo da carcinogênese do glioma (cérebro) é proposto neste estudo.O autor desenha no PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Todos os protocolos experimentais neste estudo, incluindo o uso de animais, estavam de acordo com as Diretrizes Éticas Padrão do Comitê de Usuários e Cuidados com Animais da Universidade Nacional de Seul e foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Escola de Medicina da Universidade Nacional de Seul (número IRB SNU- 150715).-2).Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as recomendações ARRIVE.
A micróglia de camundongo BV2 e as células de glioma humano U87 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Welgene, Seul, Coréia) e meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), respectivamente, cada um contendo 10% de soro fetal bovino, 4 mM l- glutamina, penicilina 0,2 mM e estreptomicina 0,05 mM.As células foram cultivadas em uma incubadora com 5% de CO2 a 37°C.Outra linha celular de glioma, U118, foi usada para comparação com células U87.
Para isolar os exossomos das cepas RH e ME49 infectadas por T. gondii, taquizoítos de T. gondii (cepa RH) foram colhidos da cavidade abdominal de camundongos BALB/c de 6 semanas de idade, injetados 3-4 dias antes.Os taquizoítos foram lavados três vezes com PBS e purificados por centrifugação em Percoll a 40% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA)43.Para obter taquizoítos da cepa ME49, camundongos BALB/c foram injetados intraperitonealmente com 20 cistos teciduais e a transformação de taquizoítos em cistos foi coletada por lavagem da cavidade abdominal no 6-8º dia após a infecção (PI).Camundongos infectados com PBS.Os taquizoítos ME49 foram cultivados em células suplementadas com 100 μg/ml de penicilina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, EUA), 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco/BRL) e 5% de soro fetal bovino (Lonza, Walkersville, MD). .., EUA) a 37 °C e 5% de dióxido de carbono.Após o cultivo em células Vero, os taquizoítos ME49 foram passados ​​duas vezes por uma agulha de calibre 25 e depois por um filtro de 5 µm para remover detritos e células.Após a lavagem, os taquizoítos foram ressuspensos em PBS44.Os cistos teciduais da cepa ME49 de Toxoplasma gondii foram mantidos por injeção intraperitoneal de cistos isolados do cérebro de camundongos C57BL/6 infectados (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Coréia).Os cérebros de camundongos infectados com ME49 foram colhidos após 3 meses de PI e picados sob um microscópio para isolar cistos.Os camundongos infectados foram mantidos sob condições especiais livres de patógenos (SPF) na Escola de Medicina da Universidade Nacional de Seul.
O RNA total foi extraído de exossomos derivados de BV2, células e tecidos de BV2 usando o miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante, incluindo o tempo de incubação para a etapa de eluição.A concentração de RNA foi determinada em um espectrofotômetro NanoDrop 2000.A qualidade dos microarranjos de RNA foi avaliada usando um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Holanda).
DMEM com 10% de FBS pobre em exossomos foi preparado por ultracentrifugação a 100.000g por 16 horas a 4°C e filtrado através de um filtro de 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, EUA).Células BV2, 5 × 105, foram cultivadas em DMEM contendo 10% de FBS com depleção de exossomos e 1% de antibióticos a 37°C e 5% de CO2.Após 24 horas de incubação, taquizoítos da cepa RH ou ME49 (MOI = 10) foram adicionados às células e os parasitas não invasores foram removidos em uma hora e recarregados com DMEM.Exossomas de células BV2 foram isolados por centrifugação diferencial modificada, o método mais utilizado.Ressuspenda o exossomo pellet em 300 µl PBS para RNA ou análise de proteínas.A concentração de exossomos isolados foi determinada usando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA) e um espectrofotômetro NanoDrop 2000.
Os precipitados de células BV2 ou exossomos derivados de BV2 foram lisados ​​em solução de extração de proteína PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Coréia) e as proteínas foram carregadas em géis de poliacrilamida SDS 10% corados com azul brilhante de Coomassie.Além disso, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF por 2 horas.Western blots foram validados usando o anticorpo Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) como marcador exossomal.IgG de cabra anti-camundongo conjugada com HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EUA) e um analisador de imagens luminescentes LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tóquio, Japão) foram usados ​​como anticorpo secundário..A microscopia eletrônica de transmissão foi realizada para estudar o tamanho e a morfologia dos exossomos.Exossomos isolados de células BV2 (6,40 µg/µl) foram preparados em malhas revestidas com carbono e corados negativamente com acetato de uranila 2% por 1 min.As amostras preparadas foram observadas a uma tensão de aceleração de 80 kV usando um JEOL 1200-EX II (Tóquio, Japão) equipado com uma câmera ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, EUA).
Os exossomos derivados de BV2 foram corados usando o kit PKH26 Red Fluorescent Linker (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) por 15 minutos em temperatura ambiente.Células U87, 2 × 105, com exossomos marcados com PKH26 (vermelho) ou sem exossomos como controle negativo, foram incubadas a 37°C por 24 horas em uma incubadora de 5% de CO2.Os núcleos das células U87 foram corados com DAPI (azul), as células U87 foram fixadas em paraformaldeído a 4% por 15 min a 4 ° C e depois analisadas em um sistema de microscópio confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Alemanha).observável.
O cDNA foi sintetizado a partir do siRNA usando a síntese da primeira fita do siRNA Mir-X e o kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japão).A PCR quantitativa em tempo real foi realizada usando o sistema de detecção de PCR em tempo real iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) usando primers e modelos misturados com SYBR Premix.O DNA foi amplificado por 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 segundos e anelamento a 60°C por 60 segundos.Os dados de cada reação de PCR foram analisados ​​usando o módulo de análise de dados do software do sistema óptico iQ™5 (Bio-Rad).Alterações relativas na expressão gênica entre genes alvo selecionados e β-actina/siRNA (e U6) foram calculadas usando o método da curva padrão.As sequências de primer usadas são mostradas na Tabela 1.
3 x 104 células de glioma U87 foram semeadas em placas de 96 poços e misturadas com exossomos infectados por Toxoplasma derivados de BV2 (50 μg/mL) ou exossomos não pulsados ​​derivados de BV2 (50 μg/mL) como controles em 12, 18 e 36 horas .A taxa de proliferação celular foi determinada usando o Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) (Figuras Suplementares S1-S3) 46 .
Camundongos nus BALB/c fêmeas de 5 semanas de idade foram adquiridos da Orient Bio (Seongnam-si, Coréia do Sul) e mantidos individualmente em gaiolas estéreis à temperatura ambiente (22±2°C) e umidade (45±15°C).%) em temperatura ambiente (22±2°C) e umidade (45±15%).Um ciclo de luz de 12 horas e um ciclo de escuridão de 12 horas foram realizados sob SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Os camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos de 5 camundongos cada e todos os grupos foram injetados subcutaneamente com 400 ml de PBS contendo 1 x 107 células de glioma U87 e fator de crescimento reduzido BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, EUA).Seis dias após a injeção do tumor, 200 mg de exossomos derivados de células BV2 (com/sem infecção por Toxoplasma) foram injetados no local do tumor.Vinte e dois dias após a infecção do tumor, o tamanho do tumor de camundongos em cada grupo foi medido com um paquímetro três vezes por semana, e o volume do tumor foi calculado pela fórmula: 0,5×(largura)×2×comprimento.
Análise de expressão de microRNA usando miRCURYTM LNA miRNA array, 7ª geração has, mmu e rno arrays (EXIQON, Vedbaek, Dinamarca) cobrindo 1119 camundongos bem caracterizados entre 3100 sondas de captura de miRNA humanos, camundongos e ratos.Durante este procedimento, 250 a 1000 ng de RNA total foram removidos do 5'-fosfato por tratamento com fosfatase alcalina intestinal de bezerro seguido de marcação com corante fluorescente verde Hy3.As amostras marcadas foram então hibridizadas carregando lâminas de microarray usando um kit de câmara de hibridação (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e um kit de lâmina de hibridação (Agilent Technologies).A hibridação foi realizada por 16 horas a 56°C, em seguida os microarrays foram lavados de acordo com as recomendações do fabricante.As lâminas de microarray processadas foram então digitalizadas usando um sistema de scanner de microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).As imagens digitalizadas foram importadas usando o software Agilent Feature Extraction versão 10.7.3.1 (Agilent Technologies) e a intensidade de fluorescência de cada imagem foi quantificada usando o arquivo GAL correspondente do protocolo Exiqon modificado.Os dados do microarray para o estudo atual são depositados no banco de dados GEO sob o número de acesso GPL32397.
Perfis de expressão de miRNAs exossomais maduros na micróglia de cepas RH ou ME49 infectadas com Toxoplasma foram analisados ​​usando várias ferramentas de rede.Os miRNAs associados ao desenvolvimento do tumor foram identificados usando miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) e filtrados com intensidade de sinal normalizada (log2) superior a 8,0.Entre os miRNAs, os miRNAs expressos diferencialmente foram alterados em mais de 1,5 vezes pela análise de filtro de miRNAs alterados por cepas RH ou ME49 infectadas com T. gondii.
As células foram semeadas em placas de seis poços (3 x 105 células/poço) em opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).As células transfectadas foram cultivadas durante 6 horas e depois o meio foi mudado para meio completo fresco.As células foram colhidas 24 horas após a transfecção.
A análise estatística foi realizada principalmente por meio do teste t de Student com software Excel (Microsoft, Washington, DC, EUA).Para análise animal experimental, uma ANOVA de duas vias foi realizada usando o software Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值 < 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Todos os protocolos experimentais usados ​​neste estudo foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Escola de Medicina da Universidade Nacional de Seul (número IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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