Giardia duodenum é um organismo parasita que causa giardíase, uma infecção intestinal especialmente comum em crianças pequenas com sinais clínicos de diarreia.Nós relatamos anteriormente que G. duodenalis extracelular desencadeia a ativação de nucleotídeos de ligação ao receptor intracelular semelhante à oligomerização 3 (NLRP3) e regula as respostas inflamatórias do hospedeiro através da secreção de vesículas extracelulares (EV).No entanto, os padrões moleculares exatos do EV duodenocócico associado ao patógeno (GEV) envolvido neste processo e o papel do inflamassoma NLRP3 na giardíase ainda precisam ser elucidados.
Os plasmídeos de expressão eucariótica recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 giardinas em GEV foram construídos, transfectados em macrófagos peritoneais primários de camundongos e detectados medindo a molécula alvo da inflamação caspase-1.O nível de expressão p20 foi rastreado..As giardinas alfa-2 e alfa-7.3 de G. duodenalis foram originalmente identificadas medindo o inflamassoma NLRP3 (NLRP3, pró-interleucina-1 beta [IL-1β], pró-caspase-1 e caspase-1 p20), secreção de IL.Níveis 1β, níveis de oligomerização de proteína manchada apoptótica (ASC) e localização imunofluorescente de NLRP3 e ASC.O papel do inflamassoma NLRP3 na patogenicidade de G. duodenalis foi então avaliado usando camundongos nos quais a ativação de NLRP3 foi bloqueada (camundongos bloqueados por NLRP3) e alterações patológicas no peso corporal, carga parasitária duodenal e tecido duodenal foram monitoradas.Além disso, investigamos se as hiardinas alfa-2 e alfa-7.3 induzem a secreção de IL-1β in vivo através do inflamassoma NLRP3 e determinamos o papel dessas moléculas na patogenicidade de G. duodenalis em camundongos.
As giardinas alfa-2 e alfa-7.3 induzem a ativação do inflamassoma NLRP3 in vitro.Isso levou à ativação da p20 caspase-1, aumento nos níveis de expressão das proteínas NLRP3, pró-IL-1β e pró-caspase-1, aumento significativo na secreção de IL-1β, formação de manchas ASA no citoplasma e a indução da oligomerização do AAS.Inflamação de NLRP3 A perda peniana exacerba a patogenicidade de G. duodenalis em camundongos.Camundongos tratados com cistos por gavagem de camundongos bloqueados com NLRP3 exibiram um número aumentado de trofozoítos e danos graves às vilosidades duodenais, caracterizados por criptas necróticas com encolhimento e ramificação.Experimentos in vivo mostraram que as giardinas alfa-2 e alfa-7.3 podem induzir a secreção de IL-1β através do inflamassoma NLRP3, e a imunização com giardinas alfa-2 e alfa-7.3 reduziu a patogenicidade de G. duodenalis em camundongos.
Tomados em conjunto, os resultados deste estudo sugerem que a giardia alfa-2 e alfa-7.3 causam regulação positiva da inflamação do hospedeiro NLRP3 e reduzem a infectividade de G. duodenalis em camundongos, que são alvos promissores para a prevenção da giardíase.
Giardia duodenum é um parasita protozoário extracelular que vive no intestino delgado e causa 280 milhões de casos de giardíase com diarreia anualmente, especialmente entre crianças pequenas em países em desenvolvimento [1].As pessoas são infectadas ao beber água ou alimentos contaminados com cistos de M. duodenum, que entram no estômago e são excretados no suco gástrico.Os trofozoítos de Giardia duodenum fixam-se ao epitélio duodenal, causando náuseas, vômitos, diarreia, dor abdominal e perda de peso.Indivíduos com imunodeficiência e fibrose cística são suscetíveis à infecção.A infecção também pode ocorrer através do sexo oral e anal [2].Drogas como metronidazol, tinidazol e nitazoxanida são as opções de tratamento preferidas para infecções duodenais [3].No entanto, essas drogas quimioterápicas causam efeitos colaterais adversos, como náusea, carcinogênese e genotoxicidade [4].Portanto, estratégias mais eficazes precisam ser desenvolvidas para prevenir a infecção por G. duodenalis.
Os inflamassomas são uma classe de complexos proteicos citosólicos que fazem parte da resposta imune inata, ajudando na defesa contra a invasão de patógenos e na mediação de respostas inflamatórias [5].Entre esses inflamassomas, o inflamassoma semelhante à ligação de nucleotídeos do receptor 3 de oligomerização de ligação a nucleotídeos (NLRP3) (NLRP3) foi extensivamente estudado porque pode ser detectado por vários padrões moleculares associados a patógenos/danos (PAMP/ DAMP), reconhece, ativa o sistema imunológico inato.e regula a homeostase intestinal em muitas doenças inflamatórias [6,7,8].Consiste no receptor de reconhecimento de padrões (PRR) NLRP3, uma proteína manchada apoptótica adaptadora (ASC) e um efetor procaspase-1 ou procaspase-11.O inflamassoma NLRP3 atua como hospedeiro contra a invasão de patógenos, conforme observado nos estudos de Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] e Leishmania.[11], mas também foi relatado que a ativação do inflamassoma NLRP3 limita as respostas imunes protetoras e exacerba a progressão da doença, por exemplo, em vermes [12].Com base em nossas descobertas anteriores, relatamos que G. duodenalis extracelular desencadeia a ativação intracelular da inflamação de NLRP3 e modula as respostas inflamatórias do hospedeiro através da secreção de vesículas extracelulares (EVs) [13].No entanto, o papel do inflamassoma NLRP3 na infecção por G. duodenalis in vivo ainda precisa ser determinado.
As giardinas foram originalmente descritas como componentes estruturais do citoesqueleto de G. duodenalis e desempenham um papel importante na motilidade dos trofozoítos e na fixação das células epiteliais no intestino delgado.Para melhor se adaptar ao ambiente e aumentar sua patogenicidade, os trofozoítos de G. duodenalis desenvolveram uma estrutura citoesquelética única que consiste em 8 flagelos, 1 corpo médio e 1 disco ventral [14].Os trofozoítos de Giardia duodenum usam seu citoesqueleto para penetrar na parte superior do intestino delgado, especialmente no duodeno, e se fixarem nos enterócitos.Eles migram constantemente e se ligam às células epiteliais usando o metabolismo celular.Portanto, existe uma estreita relação entre seu citoesqueleto e virulência.Giardinas específicas para Giardia duodenum são componentes da estrutura do citoesqueleto [15] e são divididas em quatro classes: α-, β-, γ- e δ-giardinas.Existem 21 membros da família α-giardin, todos com capacidade dependente de cálcio de se ligarem a fosfolipídios [16].Eles também conectam o citoesqueleto à membrana celular.Em indivíduos com diarreia causada por G. duodenalis, as α-giardins são altamente expressas e imunorreativas durante a infecção [17].Vacinas heterólogas baseadas em Giardia alfa-1 protegem contra giardíase em camundongos e são potenciais candidatos a antígenos para o desenvolvimento de vacinas [18].A giardina alfa-8, localizada na membrana plasmática e nos flagelos, mas não no disco ventral, aumenta a motilidade e a taxa de crescimento dos trofozoítos em G. duodenalis [19].A alfa-14 giardina se liga às estruturas dos microtúbulos nos flagelos e afeta a viabilidade de G. duodenalis [20].A giardina alfa-11 está presente em abundância ao longo do ciclo de vida, e a superexpressão da giardina alfa-11 danifica a própria G. duodenalis [21].No entanto, não está claro se a alfa-2 giardina e a alfa-7.3 giardina protegem contra a infecção por G. duodenalis e seus mecanismos subjacentes.
Neste estudo, os plasmídeos de expressão eucariótica recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina foram transfectados em macrófagos peritoneais primários de camundongos para ativar o hospedeiro NLRP3.Os alvos do inflamassoma foram então selecionados.Também avaliamos o papel do inflamassoma NLRP3 na patogenicidade de G. duodenalis, investigamos se as giardinas alfa-2 e alfa-7,3 induzem a ativação do inflamassoma NLRP3 in vivo e determinamos que esses dois papéis das giardinas na patogenicidade de G. duodenalis.Nosso objetivo comum era desenvolver alvos promissores para a prevenção da infecção por G. duodenalis.
Camundongos fêmeas C57BL / 6 do tipo selvagem (WT) com idade entre 5 e 8 semanas foram adquiridos no Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, China).Os ratos tiveram livre acesso à água, receberam alimentos esterilizados e foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12/12 horas.Antes da infecção, os ratos receberam antibióticos ad libitum em água potável suplementada com ampicilina (1 mg/mL), vancomicina (1 mg/mL) e neomicina (1,4 mg/mL) (todos adquiridos em Xangai, China, organismos artificiais) [22 ].].Os ratos que perderam a capacidade de comer e beber por> 24 horas e perderam ≥ 20% do peso corporal foram sacrificados humanamente por deslocamento cervical.
Trofozoítos WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, EUA) foram suplementados com 12,5% de soro fetal bovino (FBS; Every Green, Zhejiang, China) e 0,1% de bile bovina (Sigma-Aldrich, St. Missouri, EUA). ).EUA) sob condições microaeróbicas.Trofozoítos confluentes foram coletados em gelo e passados ​​na proporção de 1:4 para posterior reprodução.
Os cistos de Giardia duodenum foram induzidos conforme descrito anteriormente [23], os trofozoítos foram colhidos em fase logarítmica e depois diluídos com meio indutor de encapsulamento, pH 7,1 (TYI-S-33 modificado) para uma concentração final de 1 × 106 trofozoítos/mL.concentração de bile 0,05% médio).Os trofozoítos foram cultivados em condições anaeróbicas a 37°C até a fase de crescimento logarítmico.Mude o meio para meio indutor de cisto (pH 7,8; ​​meio TYI-S-33 modificado com concentração de bile de 1%) e cultive G. duodenalis a 37°C por 48-96 horas, durante as quais os cistos de formação foram observados ao microscópio.Após a maioria dos trofozoítos terem sido induzidos a formar cistos, a mistura de cultura foi colhida e ressuspensa em água deionizada estéril para lisar os trofozoítos restantes.Os cistos foram contados e armazenados a 4°C para análises posteriores através de tubo gástrico em camundongos.
As vesículas extracelulares de Giardia (GEVs) foram enriquecidas conforme descrito anteriormente [13].Os trofozoítos em fase de crescimento logarítmico foram ressuspensos em meio TYI-S-33 modificado preparado com FBS esgotado em exossomo (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) até uma concentração final de 1 × 106 parasitas/mL e incubados por 12 horas.foram isolados do sobrenadante da cultura por centrifugação a 2.000 g por 10 min, 10.000 g por 45 min e 100.000 g por 60 min.Os precipitados foram dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato (PBS), quantificados usando um kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e armazenados a -80°C ou usados ​​diretamente para análises adicionais.
Macrófagos peritoneais primários de camundongos foram preparados conforme descrito anteriormente [24].Resumidamente, camundongos (com idade entre 6-8 semanas) foram injetados (intraperitonealmente [ip]) com 2,5 ml de meio de tioglicol líquido Difco a 2,98% (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) e alimentados com 3-4 paladares.Uma suspensão de macrófagos foi coletada da cavidade abdominal de camundongos após a eutanásia e centrifugada 3 vezes a 1000 g por 10 min.As células colhidas foram detectadas por citometria de fluxo utilizando o marcador CD11b até a pureza celular ser >98%, depois adicionadas a placas de cultura celular de 6 poços (4,5 x 106 células/poço) e incubadas com 10% de FBS (Bioindústria) a 37°C.e 5% de CO2.
O RNA foi extraído de 1 × 107 trofozoítos em 1 ml de reagente TRIzol (Vazyme, Nanjing, China), o DNA genômico foi extraído do RNA total de G. duodenalis usando MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) e DNA complementar (cDNA) foi sintetizado usando MonScript RTIIII Super Mix (Monad) de acordo com as instruções do fabricante.
A informação da sequência CDS para o gene alvo de G. duodenalis foi obtida do NCBI GenBank.Use o Primer 5.0 para projetar primers de clonagem contínua específicos para cada gene alvo.O primer forward (5′-3′) consiste em três partes: uma sequência sobreposta com um vetor linearizado pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) e códons iniciais ATG e GNN (se a primeira base não for G).Isso é feito para melhorar a eficiência da expressão.Além disso, pelo menos 16 pb de bases combinadas (teor de GC 40–60%/Tm aprox. 55 °C).O iniciador reverso (5'-3') consiste em duas partes, uma sequência sobreposta com um vetor linearizado por EcoRV pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) e uma base combinada de pelo menos 16 pb.(excluindo as duas últimas paradas).bases) um códon como AA ou GA para permitir que plasmídeos recombinantes expressem suas proteínas marcadas).As sequências iniciadoras estão listadas na Tabela 1 e foram sintetizadas pela Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Os alvos foram amplificados utilizando ADN polimerase Pfu (Tiangen, Pequim, China) ou Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Pequim] Co., Ltd., Pequim, China) utilizando ADNc de G. duodenalis preparado como modelo.O plasmídeo vetor de expressão eucariótico pcDNA3.1 (+) foi linearizado com a enzima de restrição EcoRV e desfosforilado usando Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Fragmentos pcDNA3.1(+) linearizados e fragmentos do gene alvo amplificado foram purificados usando um kit de purificação de gel de DNA (Tiangen) e quantificados usando um Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).O fragmento pcDNA3.1 (+) e cada fragmento do gene alvo foram recombinados usando a mistura de clonagem de montagem única MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) e confirmados por sequenciamento de DNA usando Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Os plasmídeos livres de endotoxina pcDNA3.1(+)-alfa-2 e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 foram gerados usando o Mini Kit de Plasmídeo Livre de Endotoxina SanPrep (Sangon Biotech).A concentração foi mantida acima de 500 ng/µl para garantir que o EDTA no tampão de eluição não interferiu no ensaio de transfecção.Macrófagos peritoneais primários de camundongos foram cultivados em placas de 6 poços com meio RPMI 1640 completo (Biological Industries) por 12 horas, depois as células foram lavadas 3 vezes em PBS quente para remover penicilina e estreptomicina, e depois em meio suplementado com meio completo.Os plasmídeos isentos de endotoxina pcDNA3.1(+)-alfa-2 e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 μg) foram diluídos em 125 μl de meio de soro reduzido Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Em seguida, 5 µl de reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) foram diluídos em 125 µl de meio Opti-MEM com baixo teor de soro.Prepare complexos lipossomas-DNA misturando o plasmídeo diluído isento de endotoxinas com Lipofectamine 2000 e deixando a mistura repousar à temperatura ambiente durante 5 minutos.Transfira os complexos separadamente para células em cada poço e misture lentamente.Após 4 horas, o meio de cultura celular foi substituído por 2 ml de meio RPMI 1640 completo e a cultura continuou durante 24 horas.Meio de cultura celular fresco foi adicionado às células e incubado durante vários momentos, dependendo do desenho do ensaio.
Amostras de proteínas de sobrenadantes e lisados ​​​​celulares foram preparadas conforme descrito anteriormente [25].Os parâmetros de transferência de membrana para pró-IL-1β, pró-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actina e His-tag foram de 200 mA/90 min.Para interleucina 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, EUA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Suíça) e NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Suíça) e 1:5000 visando His tag (Amylet Scientific, Wuhan, China) e β-actina (Proteintech, Wuhan, China).
A reticulação com suberato de disuccinimida (DSS) foi realizada conforme descrito anteriormente [26].As células foram lavadas 3 vezes com PBS frio e completamente lisadas com uma agulha de calibre 27 em 50 µl de tampão de reação ASC (pH 8,0) contendo Na2PO4 25 mM, NaCl 187,5 mM, HEPES 25 mM e NaHCO3 125 mM.A mistura foi centrifugada a 5000 g durante 3 min e o sedimento foi suturado com 10 µl de DSS (25 mM em DMSO) e 40 µl de tampão de reação ASC durante 30 min a 37°C.Após centrifugação a 5.000 g por 10 min, o sedimento foi dissolvido em uma solução de 40 µl de tampão de reação ASC e 10 µl de tampão de carga de proteína 6x (TransGen, Pequim, China), e então a solução foi extinta à temperatura ambiente por 15 min., Em seguida, ferva por 10 minutos.As amostras de proteínas foram então submetidas a Western blotting utilizando anticorpos primários anti-ASC (Wanleibio, Shenyang, China) a uma razão de diluição de 1:500.
Seguindo um procedimento descrito anteriormente [13], os sobrenadantes da cultura celular foram colhidos e a secreção da citocina pró-inflamatória IL-1β foi determinada usando o kit IL-1 Beta ELISA de camundongo (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Converta os valores de OD450nm em concentrações de proteína usando a curva padrão de IL-1β.
As células revestidas em lamelas foram lavadas suavemente 3 vezes em PBS quente, fixadas em fixador de células de tecido (Biosharp, Pequim, China) por 10 min à temperatura ambiente (TA), em Triton X-Permeabilize a 0,1% a 100 (diluído em PBS; Biosharp ) por 20 minutos em temperatura ambiente e bloquear em albumina de soro bovino a 5% (em PBS) por 2 horas em temperatura ambiente.As células foram então incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos primários contra ASC (diluição 1:100) ou NLRP3 (diluição 1:100), respectivamente, e IgG(H+L) de cabra anti-coelho marcada com Cy3 (1:400; EarthOx , São Francisco, CA, EUA) ou IgG de cabra anti-murganho conjugada com FITC (1:400; Earthox) durante a noite a 37°C no escuro durante 1 hora.Os núcleos foram corados com Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) durante 5 minutos e observados sob um microscópio de fluorescência (Olympus Corporation, Tóquio, Japão).
Os ratos foram divididos em quatro grupos (n = 7 em cada grupo): (i) grupo de controle negativo tratado com PBS (somente PBS; gavagem 100 µl/camundongo PBS seguido por injeção intraperitoneal diária de 100 µl/camundongo PBS 3 horas depois)., continuamente por 7 dias);(ii) grupo de controle negativo tratado com inibidor MCC950 [27] (100 µl/camundongo via gavagem de PBS, 3 horas depois, 10 mg/kg de peso corporal [PC] MCC950 [em PBS] foi administrado por via intraperitoneal diariamente, duração de 7 dias);(iii) grupo de infecção por cisto de G. duodenalis (1,5 x 106 cistos/camundongo por gavagem, 3 horas depois, 100 μl/camundongo de PBS administrado por via intraperitoneal diariamente durante 7 dias);(iv) grupo de infecção combinada de cisto de G. duodenalis grupo de tratamento com inibidor MCC950 (1,5 x 106 cistos/camundongo via gavagem, 10mg/kg de peso corporal MCC950 por via intraperitoneal diariamente durante 7 dias às 3h).O peso corporal de cada camundongo foi monitorado diariamente e todos os camundongos foram sacrificados no 7º dia.O duodeno colhido (3 cm de comprimento) foi cortado em pequenos pedaços em 1 ml de PBS, os cistos foram destruídos durante a noite em PBS a 4°C e os trofozoítos de G. duodenalis.O duodeno fresco (1 cm de comprimento) foi isolado para coloração com hematoxilina e eosina (H&E).
Os ratos foram divididos em dois grupos: (i) grupo controle MOCK e (ii) grupo inibidor MCC950.Houve cinco tratamentos em cada grupo (n = 7/grupo de tratamento): (i) grupo de controle negativo de tratamento com PBS (somente PBS; 100 µl/camundongo PBS, injeção intramuscular (IM) (tibial anterior) [28, 29];( ii) grupo de controle negativo do plasmídeo pcDNA3.1(+) (100 µg/DNA de camundongo, via injeção intramuscular (iii) grupo de controle positivo de infecção de cisto por G. duodenalis (1,5 x 106 cistos/camundongo, via gavagem) (iv) a grupo tratado com plasmídeo pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/DNA de camundongo, por injeção intramuscular) e (v) um grupo tratado com plasmídeo pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/camundongo DNA, após 12 horas de passagem, os camundongos do grupo inibidor MCC950 receberam uma injeção intraperitoneal diária de MCC950 (10 mg/kg de peso corporal) por 7 dias, enquanto os camundongos do grupo MOCK receberam um volume igual de tratamento com PBS. coletadas dos globos oculares dos camundongos e deixadas durante a noite a 4 ° C. As amostras de soro foram isoladas usando ensaio imunoenzimático (ELISA) e medições dos níveis de IL-1β.
Trinta e cinco camundongos foram divididos em cinco grupos (n=7/grupo).O Grupo 1 foi um grupo de controle negativo tratado com PBS: os camundongos receberam 100 μl de PBS por via intramuscular e 3 dias depois por gavagem.O Grupo 2 é um grupo de controle positivo infectado com cistos de G. duodenalis: os camundongos foram injetados com 100 μl de PBS e 3 dias depois 1,5 x 106 cistos/camundongo foram injetados intragastricamente.Terceiro grupo - imunização plasmidial com pcDNA3.1(+) em combinação com um grupo controle para infecção de cisto duodenal: camundongos receberam 100 μg de DNA plasmidial pcDNA3.1(+)(im) por via oral, 1,5×106 cistos/camundongo 3 para vários dias.Os grupos 4 e 5 eram plasmídeo pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina recombinante ou plasmídeo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina em combinação com infecção por cisto de G. duodenalis.Grupo experimental: camundongos receberam 100 µg de pcDNA3.ADN do plasmídeo 1(+)-giardine (im), depois 3 dias mais tarde, 1,5 x 106 cistos/ratinho foram injectados através de gavagem.O peso corporal de cada camundongo foi monitorado após a introdução do cisto de G. duodenalis através do tubo.O duodeno fresco foi coletado para medições de carga parasitária e análise de coloração HE.
As alterações histopatológicas foram analisadas de acordo com procedimento publicado anteriormente [30].O duodeno fresco foi fixado com fixador de células teciduais, embebido em parafina, cortado em seções de 4 μm, corado com H&E e analisado ao microscópio óptico.Alterações patológicas representativas em sete secções de tecido de sete ratinhos independentes foram avaliadas por um patologista que desconhecia o tratamento e foram capturadas com uma ampliação de 200x.O comprimento das vilosidades e a profundidade das criptas foram medidos de acordo com os métodos descritos anteriormente.
Os resultados in vitro e in vivo foram obtidos em triplicata.Os gráficos foram gerados usando GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA).As diferenças entre dois grupos foram analisadas pelo teste t, enquanto as diferenças entre ≥3 grupos foram analisadas por análise de variância unidirecional (ANOVA) usando o software SPSS (versão 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, EUA).Os dados foram analisados ​​quanto à homogeneidade de variância utilizando o teste de Levene seguido pelo teste post hoc de Bonferroni (B).A significância é expressa como P<0,05, P<0,01 e P<0,001 (não significativo [ns]) (P>0,05).
Nossa análise anterior da proteômica do GEV na Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) mostrou que muitos alvos podem estar envolvidos na ativação de vias de sinalização inflamatória [13].Selecionamos dois alvos promissores, giardinas alfa-2 e alfa-7.3, amplificamos essas moléculas e as utilizamos para construir o vetor de expressão eucariótico pcDNA3.1(+).Após o sequenciamento, os plasmídeos de expressão pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 giardina recombinantes foram transfectados em macrófagos peritoneais primários de camundongos, e a proteína de assinatura caspase-1 p20 da inflamação (um fragmento de caspase-1 ativada) foi identificada como elucidação de moléculas-chave que podem desencadear inflamação.Os resultados mostraram que as giardinas alfa-2 e alfa-7.3 podem induzir a expressão da caspase-1 p20 semelhante ao GEV.Nenhum efeito na ativação da caspase-1 foi encontrado no controle negativo não tratado (somente PBS) e no controle do plasmídeo pcDNA3.1(+) (Figura 1).
Medição da ativação da p20 caspase-1 por pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 giardinas.Os plasmídeos de expressão eucarióticos recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 giardinas (acima de cada pista) foram transfectados em macrófagos peritoneais primários de camundongo e os sobrenadantes da cultura foram colhidos 24 horas depois.Western blotting foi usado para medir os níveis de expressão da proteína do inflamassoma caspase-1 p20.O grupo de tratamento apenas com PBS (pista C) e o grupo de monoterapia pcDNA3.1(+) (pista pcDNA3.1) foram utilizados como controle negativo, e o grupo de tratamento GEV foi usado como controle positivo.A expressão da proteína recombinante foi confirmada pela detecção de um marcador de histidina em cada proteína, e as bandas proteicas esperadas eram alfa-2 giardina (38,2 kDa) e alfa-7,3 giardina (37,2 kDa).GEV, vesículas extracelulares de Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vetor linearizado por EcoRV, SUP, sobrenadante
Para determinar se alfa-2 giardina e alfa-7.3 giardina induzem a expressão de p20 caspase-1 e desempenham um papel na ativação da resposta inflamatória NLRP3 do hospedeiro, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine e pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardina foi transfectada em macrófagos peritoneais primários de camundongos com DNA plasmídico recombinante, e os níveis de expressão, localização e oligomerização das principais proteínas inflamatórias NLRP3 foram determinados.Nesta experiência, GEV foi utilizado como grupo de controlo positivo, e o grupo sem tratamento (apenas PBS) ou o grupo de tratamento com transfecção pcDNA3.1(+) foi o grupo negativo.Os resultados mostraram que, assim como no grupo GEV, o DNA plasmidial recombinante de giardina pcDNA3.1(+)-alfa-2 e giardina pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 resultou na regulação positiva de NLRP3, pró-IL-1β e ativação de procaspase-1 e caspase-1 (Fig. 2a).Além disso, ambas as giardinas induziram secreção significativa de IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardina: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figura 2b).A maioria das proteínas ASC eram monoméricas no grupo sem tratamento ou no grupo de tratamento transfectado com o plasmídeo pcDNA3.1(+), em contraste com pcDNA3.1(+)-alfa-2 ou pcDNA3.1(+)-alfa- 7,3 giardina.A oligomerização ASC ocorreu no DNA plasmidial recombinante do grupo ou grupo controle positivo GEV, apresentando uma forma oligomérica (Figura 2c).Esses dados preliminares sugerem que a alfa-2 giardina e a alfa-7,3 giardina podem induzir a ativação da inflamação do NLRP3.Estudos imunofluorescentes subsequentes da localização de ASC e NLRP3 mostraram que no grupo de controle negativo, a proteína ASC estava espalhada por todo o citoplasma e apareceu como um sinal de ponto após estimulação de pcDNA3.1(+)-alfa-2 com giardina ou pcDNA3.Grupo 1(+)-alfa-7,3 giardina ou grupo controle positivo GEV (Figura 2d).Nos grupos controle negativo e pcDNA 3.1 tratados com plasmídeo, o sinal da proteína NLRP3 não foi detectado, enquanto um ponto de sinal fluorescente em resposta a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina ou pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 foi detectado..giardina são encontradas no citoplasma ou após estimulação do HEV (Fig. 2e).Estes dados demonstram ainda que G. duodenalis giardin alfa-2 e giardin alfa-7.3 ativam o inflamassoma NLRP3 em macrófagos peritoneais primários de camundongos.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina ativam o inflamassoma NLRP3 em macrófagos peritoneais de camundongos.Transfectar os plasmídeos de expressão eucariótica recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina em células e macrófagos peritoneais murinos primários, ou colher o sobrenadante dentro de 24 h para análise de expressão, oligomerização , secreção.e localização das principais proteínas inflamatórias.O grupo somente PBS (C) e o grupo de tratamento único pcDNA3.1(+) foram utilizados como controle negativo, e o grupo de tratamento GEV foi utilizado como grupo positivo.a As principais proteínas inflamatórias NLRP3, incluindo NLRP3, pró-IL-1β, pró-caspase-1 e p20 caspase-1, foram detectadas por Western blotting.b Os níveis de secreção de IL-1β nos sobrenadantes foram determinados utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA).As diferenças entre os grupos controle e experimental foram analisadas por análise de variância unidirecional (ANOVA) usando o software SPSS versão 22.0.Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos **P<0,01 e ***P<0,001.c Os níveis de oligomerização de ASC em pellets foram determinados por análise de reticulação de DSS, enquanto os níveis de ASC em lisados ​​​​celulares foram utilizados como controlo de carga.d Visualização da localização do ISC utilizando imunofluorescência.A imunofluorescência foi utilizada para visualizar a localização do NLRP3.ASC, proteína tipo partícula apoptótica;IL, interleucina;NLRP3, receptor 3 semelhante à oligomerização de ligação a nucleotídeos;ns, não significativo (P > 0,05)
Tanto G. duodenalis quanto os GEVs que ele secreta ativam o inflamassoma NLRP3 e regulam as respostas inflamatórias do hospedeiro in vitro.Assim, o papel do inflamassoma NLRP3 na patogenicidade de G. duodenalis permanece obscuro.Para investigar esta questão, projetamos um experimento entre camundongos infectados com cisto de G. duodenalis e camundongos infectados com cisto de G. duodenalis + tratamento com inibidor MCC950 e comparamos a expressão do inflamassoma NLRP3 quando infectados com cisto de G. duodenalis.Um esquema detalhado do experimento é mostrado na Fig.As alterações no peso corporal dos camundongos em diferentes grupos de tratamento foram monitoradas durante 7 dias após a infecção com cistos, e os resultados são mostrados na Fig.Comparado ao grupo tratado com PBS puro, os resultados mostraram que (i) o peso corporal dos camundongos infectados com cisto de G. duodenalis diminuiu do dia 3 ao dia 7 após a infecção;(ii) o tratamento com o inibidor MCC950 não teve efeito significativo no peso corporal dos ratos..Em comparação com o grupo de infecção única, o peso corporal do grupo de infecção duodenal tratado com MCC950 diminuiu em graus variados (Dia 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Dia 2: ANOVA, F(3, 24 ) = 0,4602, P<0,0001; Dia 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010 Dia 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Dia 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202;Estes dados demonstram que o inflamassoma NLRP3 protege os ratos da perda significativa de peso nas fases iniciais (2-4 dias) da infecção duodenal.Nosso objetivo então foi detectar trofozoítos de G. duodenalis no líquido de lavagem duodenal e os resultados são mostrados na Figura 3c.Em comparação com o grupo de infecção por cisto de G. duodenalis, o número de trofozoítos no duodeno aumentou significativamente após o bloqueio do inflamassoma NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Os tecidos duodenais corados com HE mostraram, em comparação com o controle negativo tratado apenas com PBS e MCC950: ​​(i) a infecção do cisto de G. duodenalis resultou em danos às vilosidades duodenais (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0488 ) e atrofia de criptas (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodeno de camundongos infectados com cistos de G. duodenalis e tratados com inibidores MCC950.vilosidades duodenais foram danificadas e mortas (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) com atrofia e ramificação da cripta (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Estes resultados sugerem que o inflamassoma NLRP3 desempenha um papel na redução da patogenicidade de G. duodenalis.
Papel do inflamassoma NLRP3 na infecção por Giardia duodenum.Os ratos foram submetidos a gavagem (iv) com cistos duodenocócicos e depois tratados com ou sem MCC950 (ip).Grupos de tratamento único com PBS ou MCC950 foram utilizados como controles.Grupo experimental e regime de tratamento.b O peso corporal dos ratos em cada um dos vários grupos de tratamento foi monitorizado durante 7 dias.A diferença entre o grupo de infecção por G. duodenalis e o grupo de tratamento de infecção por G. duodenalis + MCC950 foi analisada pelo teste t usando o software SPSS versão 22.0.Os asteriscos indicam diferenças significativas em *P<0,05, **P<0,01 ou ***P<0,001.c A carga parasitária foi determinada pela contagem do número de trofozoítos no líquido de lavagem duodenal.A diferença entre o grupo de infecção por G. duodenalis e o grupo de tratamento de infecção por G. duodenalis + MCC950 foi analisada pelo teste t usando o software SPSS versão 22.0.Os asteriscos indicam diferenças significativas em *P < 0,05.d Resultados de coloração com hematoxilina e eosina (H&E) da histopatologia duodenal.As setas vermelhas indicam danos nas vilosidades, as setas verdes indicam danos nas criptas.Barra de escala: 100 μm.e, f Análise estatística da altura das vilosidades duodenais e da altura das criptas de camundongos.Os asteriscos indicam diferenças significativas em *P<0,05 e **P<0,01.Os resultados são retirados de 7 experimentos biológicos independentes.PC, peso corporal;ig, via de entrega intragástrica;ip, via de entrega intraperitoneal;ns, não significativo (P > 0,05);PBS, solução salina tamponada com fosfato;WT, tipo selvagem
A secreção de IL-1β é uma marca registrada da ativação da inflamação.Para determinar se G. duodenalis alfa-2 giardina e alfa-7.3 giardina ativam o inflamassoma hospedeiro NLRP3 in vivo, utilizamos camundongos WT não tratados (grupo sham) e camundongos bloqueados por inflamassoma NLRP3 (grupo de tratamento inibido por MCC950).Um esquema detalhado do experimento é mostrado na Fig.Os grupos experimentais consistiram em camundongos tratados com PBS, tratamento de cisto de G. duodenalis por gavagem, injeção intramuscular de pcDNA3.1 e injeção intramuscular de pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina ou pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina.No 7º dia após a administração intramuscular do plasmídeo recombinante, foi coletado soro e determinado o nível de IL-1β em cada grupo.Como mostrado na Figura 4b, no grupo MOCK: (i) comparado ao grupo PBS, o tratamento com pcDNA3.1 não teve efeito significativo na secreção de IL-1β (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), no entanto, A secreção de IL-β foi significativamente elevada no grupo de cistos de G. duodenalis (ANOVA, F (4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine e pcDNA3.1- A injeção intramuscular de alfa-7,3 giardina aumentou significativamente os níveis séricos de IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina induziu altos níveis de secreção de IL -1β no grupo de injeção intramuscular de pcDNA3.1-alfa-2 giardina (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Comparado com cada grupo no grupo de tratamento MCC950 e no grupo MOCK: (i) os níveis de secreção de IL-1β no grupo de controle PBS e no grupo de controle pcDNA3.1 diminuíram até certo ponto após o bloqueio do inibidor MCC950, mas a diferença não foi significativo (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) após bloquear o MCC950., a secreção de IL-1β foi significativamente reduzida no grupo infectado por cisto de G. duodenalis, no grupo pcDNA3.1-alfa-2 giardina e no grupo pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; ) = 3,540, P = 0,0164).Estes resultados sugerem que a alfa-2 giardina e a alfa-7.3 giardina medeiam a ativação do inflamassoma NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardinas ativam o inflamassoma hospedeiro NLRP3 in vivo.Os camundongos foram imunizados (IM) com o plasmídeo de expressão eucariótica recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina ou pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina e depois tratados com MCC950 (ip; grupo MCC950) ou não (grupo fictício ).O grupo de tratamento com plasmídeo PBS ou pcDNA3.1(+) foi utilizado como controle negativo, o grupo de tratamento com cisto de G. duodenalis foi utilizado como controle positivo.Grupo experimental e regime de tratamento.b Os níveis séricos de IL-1β em camundongos foram medidos no dia 7 por ensaio ELISA.As diferenças entre os grupos do grupo MOCK foram analisadas por meio de ANOVA unidirecional, e as diferenças entre o grupo MOCK e o grupo MCC950 foram analisadas por meio do teste t do software SPSS versão 22.0.Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos de tratamento no grupo MOCK, *P<0,05 e ***P<0,001;cifrões ($) indicam diferenças significativas entre cada grupo no grupo MOCK e no grupo MCC950 em P<0,05.Resultados de sete experimentos biológicos independentes.i, injeção intramuscular, ns, não significativo (P > 0,05)
Para investigar o efeito da ativação mediada por alfa-2 e alfa-7.3 giardina do inflamassoma hospedeiro NLRP3 na infectividade de G. duodenalis, usamos camundongos WT C57BL / 6 e injetamos alfa-2 giardina e alfa-7.3 giardina.o plasmídeo foi injetado por via intramuscular, após 3 dias através do tubo gástrico do cisto de G. duodenalis, após o que os camundongos foram observados por 7 dias.Um esquema detalhado do experimento é mostrado na Fig.O peso corporal de cada camundongo foi medido todos os dias, amostras de tecido duodenal fresco foram coletadas no 7º dia após a administração através de sonda gástrica, o número de trofozoítos foi medido e alterações histopatológicas foram observadas.Como mostrado na Figura 5b, com o aumento do tempo de alimentação, o peso corporal dos camundongos em cada grupo aumentou gradualmente.A MT dos camundongos começou a diminuir no 3º dia após a administração intragástrica de cistos de G. duodenalis e depois aumentou gradativamente.A ativação do inflamassoma NLRP3 induzido por injeção intramuscular de alfa-2 giardina e alfa7.3 giardina atenuou significativamente a perda de peso em camundongos (Dia 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Dia 1: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Dia 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Dia 2: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dia 3: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Dia 4: pcDNA3.1-alfa-2 giardina, ANOVA; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dia 4: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Dia 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dia 5: pcDNA3.1-alpha -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dia 6: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Dia 6: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dia 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dia 7: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).A carga parasitária foi avaliada no duodeno (Fig. 5c).Comparado ao controle positivo não tratado e ao grupo injetado com o vetor pcDNA3.1 vazio, o número de trofozoítos de G. duodenalis foi significativamente reduzido nos grupos injetados com α-2 giardina e α-7,3 giardina (pcDNA3.1-alpha -2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Além disso, a giardina alfa-7,3 foi mais protetora em camundongos do que a giardina alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Os resultados da coloração HE são mostrados na fig.5d-f.Camundongos injetados com alfa-2 giardina e alfa-7.3 giardina tiveram menos lesões no tecido duodenal, manifestadas por danos nas vilosidades, em comparação com camundongos injetados com G. duodenalis e camundongos injetados com G. duodenalis em combinação com um vetor pcDNA3 vazio .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 ou P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 ou P = 0,0055) e redução da atrofia das criptas (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 ou P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 ou P = 0,0191).Estes resultados sugerem que a alfa-2 giardina e a alfa-7,3 giardina reduzem a infectividade de G. duodenalis ativando o inflamassoma NLRP3 in vivo.
Papel das pcDNA3.1(+)-giardins na infecção por G. duodenalis.Os camundongos foram imunizados (IM) com plasmídeos de expressão eucariótica recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina ou pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina e depois desafiados com cistos de G. duodenalis (ig).O grupo PBS e o grupo de tratamento pcDNA3.1(+) + cisto duodenal foram utilizados como grupos de controle negativo, e o grupo de tratamento de cisto duodenal foi utilizado como grupo de controle positivo.Grupo experimental e regime de tratamento.b A MT dos ratinhos em cada um dos vários grupos de tratamento foi monitorizada durante 7 dias após o desafio.Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos do grupo G. duodenalis e do grupo pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina, *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001;o cifrão ($) indica uma diferença significativa entre cada grupo de G. duodenalis e o grupo pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 jardine, $$P<0,01 e $$$P<0,001.c A carga parasitária foi determinada contando o número de trofozoítos em 1 ml de lavagem duodenal do duodeno (3 cm de comprimento) e expressa como o número de parasitas por cm de duodeno.As diferenças entre o grupo de infecção por G. duodenalis, o grupo pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina e o grupo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina foram analisadas por ANOVA unidirecional usando o software SPSS versão 22.0.Os asteriscos indicam diferenças significativas em **P<0,01 e ***P<0,001.d Alterações histopatológicas no duodeno.As setas vermelhas indicam danos nas vilosidades, as setas verdes indicam danos nas criptas.Barra de escala: 100 μm.e, f Análise estatística da altura das vilosidades duodenais de camundongos (e) e altura das criptas (f).As diferenças entre os grupos na Figura 1d foram analisadas por ANOVA unidirecional usando o software SPSS versão 22.0.Os asteriscos indicam diferenças significativas em *P<0,05 e **P<0,01.Resultados de sete experimentos biológicos independentes.ns, não significativo (P > 0,05)
Giardia duodenum é um parasita intestinal bem conhecido de humanos e outros mamíferos que causa giardíase.Em 2004, foi incluída na Iniciativa para Doenças Negligenciadas da OMS devido à sua elevada prevalência ao longo de 6 anos, especialmente em comunidades de baixo nível socioeconómico [32].O sistema imunológico inato desempenha um papel crítico na resposta imune à infecção por G. duodenalis.Foi relatado que macrófagos de camundongos engolfam e matam G. duodenalis liberando armadilhas extracelulares [33].Nossos estudos anteriores mostraram que G. duodenalis, um parasita extracelular não invasivo, ativa as vias de sinalização inflamatória p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 e NLRP3 em macrófagos de camundongos para regular as respostas inflamatórias do hospedeiro, e o GEV liberado pode melhorar esse processo.13], 24].No entanto, os PAMPs exatos envolvidos na inflamação regulada pelo inflamassoma NLRP3 no GEV e o papel do inflamassoma NLRP3 na giardíase ainda precisam ser elucidados.Para esclarecer essas duas questões, conduzimos este estudo.
O inflamassoma NLRP3 está localizado no citoplasma das células do sistema imunológico e pode ser ativado por diversas partículas, como cristais de ácido úrico, toxinas, bactérias, vírus e parasitas.Em estudos bacterianos, as toxinas foram identificadas como PAMPs-chave que ativam sensores inflamatórios, levando à inflamação e morte celular [34].Algumas toxinas estruturalmente diversas, como hemolisina de Staphylococcus aureus [35] e Escherichia coli [36], hemolisina BL (HBL) de enterotoxina (NHE) [37], induzem a ativação da inflamação de NLRP3.Estudos virais demonstraram que proteínas de virulência, como a proteína do envelope (E) do SARS-COV-2 [38] e a proteína NS5 do vírus Zika [39], são PAMPs importantes reconhecidos pelo receptor NLRP3.Em estudos de parasitas, foi relatado que muitos parasitas estão associados à ativação do inflamassoma do hospedeiro, como Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] e Leishmania [42].As proteínas granulares densas GRA35, GRA42 e GRA43, associadas à virulência do Toxoplasma gondii, são necessárias para a indução de piroptose em macrófagos de ratos Lewis (43).Além disso, alguns estudos de Leishmania concentraram-se em moléculas individuais envolvidas no inflamassoma NLRP3, como o lipofosfoglicano da membrana do parasita [44] ou a metaloprotease do zinco [45].Entre a família de genes alfa-giardin semelhantes à anexina, a alfa-1 giardina demonstrou ser uma potencial candidata a vacina, fornecendo proteção contra G. duodenalis em um modelo de camundongo [18].Em nosso estudo, selecionamos os fatores de virulência alfa-2 e alfa-7,3 giardinas de G. duodenalis, que são exclusivos da giárdia, mas relativamente menos relatados.Estes dois genes alvo foram clonados no vetor do sistema de expressão eucariótico pcDNA3.1(+) para análise da ativação da inflamação.
Em nosso modelo de camundongo, fragmentos de caspases clivados servem como marcadores de ativação inflamatória.Após estimulação, o NLRP3 interage com o ASC, recruta procaspases e gera caspases ativas que clivam pró-IL-1β e pró-IL-18 em IL-1β e IL-18 maduras, respectivamente -18.As caspases inflamatórias (caspases-1, -4, -5 e -11) são uma família conservada de cisteína proteases que são críticas para a defesa inata e estão envolvidas na inflamação e na morte celular programada [46].A caspase-1 é ativada por inflamassomas canônicos [47], enquanto as caspases-4, -5 e -11 são clivadas durante a formação de inflamassomas atípicos [48].Neste estudo, usamos macrófagos peritoneais de camundongos como modelo e investigamos a caspase-1 clivada pela p20 caspase-1 como um marcador de ativação da inflamação NLRP3 do hospedeiro em estudos de infecção por G. duodenalis.Os resultados mostraram que muitas alfa-giardins são responsáveis ​​pela ativação típica da inflamação, o que é consistente com a descoberta de moléculas-chave de virulência envolvidas em bactérias e vírus.No entanto, nosso estudo é apenas uma triagem preliminar e existem outras moléculas que podem ativar inflamassomas não clássicos, já que nosso estudo anterior encontrou inflamassomas clássicos e não clássicos na infecção por G. duodenalis [13].Para determinar ainda se a caspase-1 p20 gerada está associada ao inflamassoma NLRP3, transfectamos giardinas alfa-2 e alfa-7.3 em macrófagos peritoneais de camundongos para determinar os níveis de expressão de proteínas de moléculas-chave e os níveis de oligomerização de ASC, confirmando que ambas as α-giardins ativam inflamassoma NLRP3.Nossos resultados são ligeiramente diferentes daqueles de Manko-Prykhoda et al., que relataram que a estimulação de células Caco-2 apenas com cepas EPEC de G. muris ou E. coli pode aumentar a intensidade de fluorescência de NLRP3, ASC e caspase-1, embora não significativamente, enquanto a coestimulação de G. muris e E. coli aumentou os níveis de três proteínas [49].Esta discrepância pode ser devida a diferenças na seleção de espécies de Giardia, linhas celulares e células primárias.Também realizamos ensaios in vivo utilizando MCC950 em camundongos WT C57BL/6 fêmeas com 5 semanas de idade, que são mais suscetíveis a G. duodenalis.MCC950 é um inibidor potente e seletivo de NLRP3 de moléculas pequenas que bloqueia a ativação canônica e não canônica de NLRP3 em concentrações nanomolares.MCC950 inibe a ativação de NLRP3, mas não afeta a ativação das vias inflamatórias AIM2, NLRC4 e NLRP1 ou das vias de sinalização TLR [27].MCC950 bloqueia a ativação de NLRP3, mas não inibe a iniciação de NLRP3, o efluxo de K+, o influxo de Ca2+ ou a interação entre NLRP3 e ASC;em vez disso, inibe a ativação do inflamassoma NLRP3, bloqueando a oligomerização ASC [27].Portanto, utilizamos o MCC950 em um estudo in vivo para determinar o papel do inflamassoma NLRP3 após a injeção de giardina.A caspase-1 p10 ativada cliva as citocinas pró-inflamatórias pró-IL-1β e pró-IL-18 em IL-1β e IL-18 maduras (50).Neste estudo, os níveis séricos de IL-1β em camundongos tratados com giardina com ou sem MCC950 foram utilizados como um indicador para saber se o inflamassoma NLRP3 estava ativado.Como esperado, o tratamento com MCC950 reduziu significativamente os níveis séricos de IL-1β.Estes dados demonstram claramente que G. duodenalis giardin alfa-2 e giardin alfa-7.3 são capazes de ativar o inflamassoma de camundongo NLRP3.
Dados significativos acumulados na última década demonstraram que a IL-17A é o principal regulador da imunidade contra G. muris, induzindo a sinalização de IL-17RA, produzindo peptídeos antimicrobianos e regulando a ativação do complemento [51].No entanto, a infecção por Giardia ocorre mais frequentemente em adultos jovens, e foi relatado que a infecção por Giardia em ratos jovens não activa a resposta da IL-17A para exercer o seu efeito protector [52], levando os investigadores a procurar outras Giardia imunomoduladoras.mecanismos de infecção por helmintos.Os autores de um estudo recente relataram que G. muris pode ativar o inflamassoma NLRP3 pela EPEC de E. coli, o que promove a produção de peptídeos antimicrobianos e reduz sua capacidade de fixação e o número de trofozoítos no trato intestinal, reduzindo assim a gravidade do cólon. doenças causadas por bacilos [49].O inflamassoma NLRP3 está envolvido no desenvolvimento de diversas doenças.Estudos demonstraram que Pseudomonas aeruginosa desencadeia autofagia em macrófagos para evitar a morte celular, e esse processo depende da ativação do inflamassoma NLRP3 (53).Para N. caninum, a ativação do inflamassoma NLRP3 mediada por espécies reativas de oxigênio limita sua replicação no hospedeiro, tornando-o um potencial alvo terapêutico [9].Descobriu-se que Paracoccidioides brasiliensis induz a ativação do inflamassoma NLRP3 em células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos, resultando na liberação da citocina inflamatória IL-1β, que desempenha um papel crítico na defesa do hospedeiro [10].Várias espécies de Leishmania, incluindo L. amazonensis, L. major, L. braziliensis e L. infantum chagasi, ativam NLRP3 e caspase-1 dependente de ASC em macrófagos, bem como infecção por Leishmania.A replicação do parasita é aumentada em camundongos deficientes no gene NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.Foi relatado que a infecção por Leishmania induz a ativação do inflamassoma NLRP3 em macrófagos, o que limita a replicação intracelular do parasita.Assim, a Leishmania pode inibir a ativação do NLRP3 como estratégia de evitação.Em estudos in vivo, o inflamassoma NLRP3 contribuiu para a eliminação da Leishmania, mas não afetou os tecidos [54].Por outro lado, em estudos de helmintíases, a ativação do inflamassoma NLRP3 suprimiu a imunidade protetora do hospedeiro contra helmintíases gastrointestinais [12].Shigella é uma das principais bactérias causadoras de diarreia em todo o mundo.Essas bactérias podem induzir a produção de IL-1β através do efluxo de K+ mediado pelo receptor P2X7, espécies reativas de oxigênio, acidificação lisossomal e dano mitocondrial.O inflamassoma NLRP3 regula negativamente a fagocitose e a atividade bactericida de macrófagos contra Shigella (55).Estudos com Plasmodium demonstraram que camundongos deficientes em AIM2, NLRP3 ou caspase-1 infectados com Plasmodium produzem altos níveis de interferon tipo 1 e são mais resistentes à infecção por Plasmodium (56).No entanto, o papel da alfa-2 giardina e da alfa-7.3 giardina na indução da ativação patogênica da inflamação de NLRP3 em camundongos não é claro.
Neste estudo, a inibição do inflamassoma NLRP3 pelo MCC950 reduziu o peso corporal e aumentou o número de trofozoítos no líquido de lavagem intestinal em camundongos, resultando em alterações patológicas mais graves no tecido duodenal.A giardina alfa-2 e a giardina alfa-7.3 ativam o inflamassoma NLRP3 do camundongo hospedeiro, aumentam o peso corporal do camundongo, reduzem o número de trofozoítos no fluido de lavagem intestinal e aliviam lesões duodenais patológicas.Estes resultados sugerem que G. duodenalis pode ativar o inflamassoma hospedeiro NLRP3 via alfa-2 giardina e alfa-7,3 giardina, reduzindo a patogenicidade de G. duodenalis em camundongos.
Coletivamente, nossos resultados demonstram que as giardinas alfa-2 e alfa-7.3 induzem a ativação do inflamassoma hospedeiro NLRP3 e reduzem a infectividade de G. duodenalis em camundongos.Portanto, estas moléculas são alvos promissores para a prevenção da giardíase.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardíase: uma visão geral.Foi recentemente revelado que Pat Inflamm é alérgico a drogas.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardíase: uma revisão da farmacoterapia.Opinião especializada de um farmacêutico.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardíase, resistência aos medicamentos e descoberta de novos alvos.Infecta alvos de drogas do Disord.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etc. Inflamassoma NLRP3 e doenças inflamatórias.Óxido Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. O papel do inflamassoma na inflamação intestinal e no câncer.Gastroenterologia.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Ativação canônica e atípica do inflamassoma NLRP3 na encruzilhada da tolerância imunológica e da inflamação intestinal.pré-imune.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.A ativação do inflamassoma NLRP3 mediada por ROS está envolvida na resposta à infecção por N. caninum.Vetor parasita.2020;13:449.