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O transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) é caracterizado por uma deficiência na capacidade de neutralizar as respostas de medo a sinais associados ao trauma.Estudos em humanos e animais apontam para diferenças no envolvimento de certas áreas do córtex frontal como mediadores-chave que determinam o sucesso da supressão do medo, mas a interação dos circuitos neurais que determinam o envolvimento diferencial destas áreas não é clara.Para entender melhor como as diferenças individuais na recordação da extinção são refletidas nas diferenças na atividade do circuito neuronal, rotulamos as projeções do córtex sublímbico (IL) de rato com traçadores retrógrados e comparamos as projeções neuronais dentro e fora dos neurônios de projeção IL.Analisamos esses dados, agrupando-os de acordo com o grau de preservação do desbotamento da memória em ratos.Descobrimos que nas células que projetam IL, os neurônios do paratálamo posterior exibiram atividade aumentada em ratos, que exibiram boa recordação de extinção.Além das células que projetam IL, foi observado aumento da atividade de Fos em áreas selecionadas do claustro de ratos e do hipocampo ventral com boa resolução.Nossos resultados indicam que as diferenças na recordação da extinção estão associadas a padrões específicos de atividade neural dentro e fora das projeções de IL.
O condicionamento do medo ocorre quando um estímulo neutro está associado a um estímulo incondicionado aversivo (UCS), de modo que o estímulo originalmente neutro, agora o estímulo condicionado (CS), provoca uma resposta de medo condicionada (CR) na ausência do UCS.A reversão do medo condicionado foi impulsionada por uma diminuição na CR para CS devido à apresentação repetida de CS na ausência de UCS1.Pesquisas anteriores mostraram que o transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) está associado à incapacidade de lembrar a extinção das respostas condicionadas ao medo2.A pedra angular da terapia cognitivo-comportamental para o tratamento do transtorno de estresse pós-traumático é a terapia de exposição baseada na extinção das respostas de medo aprendidas3,4.Portanto, estudos de diferenças individuais no medo de extinção de roedores e mecanismos neurais subjacentes podem ajudar a elucidar diferenças nas respostas humanas ao trauma e ao tratamento do transtorno de estresse pós-traumático.Apesar do progresso na identificação dos mecanismos neurais que distinguem as memórias de extinção bem-sucedidas das malsucedidas, ainda há muito a ser descoberto.
Os modelos de roedores são úteis neste trabalho porque existem diferenças individuais significativas na lembrança da extinção de roedores7,8,9,10.Trabalhos anteriores que investigaram os mecanismos neurais de extinção do medo em nível populacional mostraram que a ativação do córtex infralíbico (IL) é necessária para a recordação da extinção (refs 11, 12, 13, mas veja 14), e alguns estudos encontraram uma diminuição na atividade de roedores em IL exibindo memória fraca sobre extinção em comparação com roedores, que são muito temidos.No entanto, os mecanismos pelos quais os ILs estão diferencialmente envolvidos na facilitação da eliminação do medo em roedores, em comparação com aqueles que apresentam uma extinção mais fraca, não são claros.
Uma possibilidade é que as diferenças na memória de extinção do medo entre os indivíduos sejam o resultado da ativação diferencial de ILs aferentes específicos.Estudos anatômicos18 demonstraram que diversas áreas corticais e subcorticais do cérebro enviam projeções densas para IL, que por sua vez envia projeções eferentes para muitas áreas do cérebro.Estudos em nível populacional mostraram que as projeções de IL para a amígdala são importantes para adquirir a extinção do medo e a entrada de IL da amígdala basolateral (BLA) também está associada ao aprendizado da extinção.Há menos pesquisas sobre o envolvimento de circuitos centrados em IL na recordação de extinção, embora trabalhos recentes sugiram que tanto o hipocampo ventral quanto o dorsal estão envolvidos na previsão de IL.As projeções eferentes do IL para o núcleo recombinado do tálamo, aparentemente, também participam da memória da extinção do medo.
Esses estudos anteriores estão começando a traçar um quadro da interação dos circuitos neurais envolvidos na recordação da extinção, mas há muito poucos dados sobre se a atividade nos circuitos neurais centrados na IL influencia as diferenças individuais na recordação da extinção.Aqui, procuramos determinar se as diferenças na memória de extinção do medo entre indivíduos estão associadas a mudanças na ativação de entrada de IL em regiões específicas do cérebro.Em particular, avaliamos a ativação de células aferentes de IL no núcleo paraventricular do tálamo (PVT), clavícula (CLA), BLA e hipocampo ventral (vHPC).Essas regiões cerebrais foram escolhidas porque enviam projeções densas para IL e porque há motivos para suspeitar que possam estar envolvidas na expressão da extinção do medo 18 .Por exemplo, um estudo recente mostrou que a PVT, uma região conhecida por estar envolvida na aquisição e reprodução do medo, é necessária para a reprodução da extinção.Além disso, estudos anteriores mostraram aumento da atividade basal da amígdala e do vHPC em ratos que expressam memória de extinção.Por fim, a análise do claustro é mais exploratória visto que nenhum dos trabalhos anteriores avaliou o seu papel na extinção.No entanto, trabalhos recentes sugerem que desempenha um papel no condicionamento contextual do medo29.
Traçadores retrógrados conjugados com GFP viral foram injetados no IL de ratos antes do teste comportamental, e a atividade de Fos nos aferentes do IL foi medida durante a repetição da extinção, recordação do medo e em ratos não submetidos a testes comportamentais.Nossos resultados indicam que as projeções do tálamo paraventricular posterior para IL mostram atividade aumentada em ratos que recordam com sucesso a extinção.Além das previsões de IL, a atividade neural em certas áreas da clavícula e do hipocampo ventral aumentou em ratos que regrediram bem.Nossos resultados mostram que padrões de atividade neural intrínseca e extrínseca projetados em IL estão associados a diferenças individuais na memória de extinção do medo.
Cinquenta e quatro ratos Sprague-Dawley machos adultos (300-325 g à chegada) obtidos de Charles River Laboratories (Raleigh, NC) foram utilizados como sujeitos.Os ratos foram alojados aos pares, com livre acesso a comida e água, em ciclo claro/escuro de 12 horas (luzes acesas às 7h).Dois grupos de ratos (n = 28 en = 26) foram utilizados para estas experiências.Após exclusão de morte, erro cirúrgico, falta de expressão de GFP no local alvo, má qualidade do tecido e problemas comportamentais (explicados em Métodos), o grupo de recall de extinção incluiu 21 ratos e o grupo de recall de medo incluiu 7 ratos, gaiolas domésticas.o grupo consistiu de 7 ratos (35 ratos foram incluídos na análise final).Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Stony Brook e estavam de acordo com as Diretrizes ARRIVE (https://arriveguidelines.org) e as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
Os ratos foram tratados dois dias antes da cirurgia.Os ratos foram anestesiados com cetamina (87 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), colocados em aparelho estereotáxico (Stoelting, Woodale, IL) e receberam injeções unilaterais de AAVrg-CAG-GFP (Addgene, 30) em IL.(equilibrar injeções esquerda e direita).Para injeção, uma cânula de calibre 22 foi colocada no lugar (AP: + 3,00, ML: ± 0,6, DV: – 5,2).Insira uma cânula interna 28G (conectada a uma bomba de infusão através de tubo PE 20) na cânula guia para fornecer 0,6 μl de vírus a uma taxa de 0,15 μl por minuto e deixe no lugar por 5 minutos após a infusão estar intacta..Após a sutura, os ratos foram injetados com meloxicam (1 mg/kg) e assim que conseguiram se movimentar foram devolvidos às suas gaiolas.Os ratos foram mantidos nas suas gaiolas durante cerca de 7 semanas para permitir a recuperação do vírus e o transporte retrógrado.Três ratos morreram sob anestesia, resultando em 51 ratos (94%) recuperando-se com sucesso da cirurgia.
Todos os procedimentos foram realizados em câmaras de condicionamento de 32 cm x 25 cm x 21 cm (Clever Systems Inc., Reston, VA) alojadas em caixas de isolamento com absorção de som de 45,7 cm x 43,2 cm x 43,2 cm (Clever Sys. Inc.).).Durante as sessões de aprendizagem de extinção e de recordação de extinção, o contexto foi alterado para ser diferente do contexto condicional original.A condição A (geração de medo) incluía lâmpadas incandescentes de 28 volts para uso doméstico (Chicago Micro Lighting, Reino Unido), enquanto a condição B (treinamento de extinção, teste de recuperação de extinção e teste de recuperação de medo) incluía lâmpadas LED infravermelhas (Univivi IR Illuminator, Shenzhen) ., China;U48R).Além disso, enquanto o Contexto A possui piso ripado antivibratório com paredes de aço inoxidável e plexiglass, o Contexto B contém inserções metálicas pintadas colocadas no piso e nas paredes.A forma do Contexto B também foi modificada colocando uma inserção metálica curva de 33,5 cm x 21,3 cm em uma câmara de condicionamento padrão.Além disso, no contexto A as câmaras foram limpas com ácido acético a 5%, enquanto no contexto B as câmaras foram limpas com hidróxido de amónio a 5%.Finalmente, no contexto B, os ratos foram trazidos para a sala de testes em baldes, em vez de serem enrolados em gaiolas ou carrinhos.As sessões comportamentais foram gravadas com a câmera superior, e o sinal de vídeo de cada câmera foi alimentado em um software (FreezeScan 2.00, Clever Sys. Inc., Reston, VA) que avaliou o comportamento do desbotamento com base nas alterações de pixel.Os parâmetros foram escolhidos de forma que o comportamento do desvanecimento estimado pelo computador corresponda ao comportamento de observadores treinados estimados manualmente.Um valor que indica a porcentagem do tempo de congelamento acumulado em um intervalo de 30 segundos.
Todos os programas comportamentais são realizados durante a parte clara do ciclo claro/escuro.Os ratos foram tratados 5 dias antes do início dos procedimentos comportamentais e transportados para a sala comportamental durante os últimos três dias de tratamento.No primeiro dia de teste comportamental, um grupo de ratos de extinção foi colocado em um reflexo condicionado pelo medo, depois colocado no contexto A, recebeu um período de aclimatação não estimulado de 6 minutos e, em seguida, recebeu ambas as combinações de 4 kHz, 76 dB, 30 s. .tom e terminação geral, 1,0 mA, kick 1 s (2 min ITI).Para todos os treinamentos comportamentais, os ratos retornaram às gaiolas 2 minutos após a última apresentação do estímulo.No dia seguinte, os ratos do grupo de recordação de extinção foram colocados na sala de contexto B e realizaram 20 apresentações sonoras (2 min ITI) como treinamento de extinção após um período de habituação de 6 min.No dia seguinte, os ratos do grupo de reprodução em extinção foram expostos a 4 tons no contexto B após um período de aclimatação de 6 minutos como teste de extinção.Os ratos do grupo de memória de extinção foram perfundidos 60 minutos após a sessão comportamental.Um grupo de ratos controle evocando memórias de medo foi submetido ao mesmo procedimento no primeiro dia da resposta condicionada pelo medo no contexto A. Quarenta e oito horas depois, os ratos foram colocados na sala de contexto B e submetidos a 4 apresentações de áudio (2- minuto ITI) como um teste de recall.medo após um período de aclimatação de 6 minutos.Os ratos foram perfundidos 60 minutos após a sessão comportamental.Um grupo de ratos domésticos de controle permaneceu em suas gaiolas durante todo o experimento e foi perfundido no mesmo dia que os ratos experimentais.Cada um dos dois grupos de ratos foi dividido em duas séries, e o número de animais em cada grupo foi equilibrado entre as séries.Um rato do grupo de memórias de medo foi excluído da análise porque não apresentou sinais de condicionamento de medo (congelamento menos de 15% do tempo durante o teste de memórias de medo).Veja a Figura 2A para um diagrama da linha do tempo comportamental.
Os ratos foram sobredosados ​​com solução Fatal Plus (100 mg/kg), depois perfundidos com PBS a 10% gelado seguido de formalina tamponada a 10%.O cérebro foi removido e armazenado numa solução de sacarose a 30% em formalina a 4°C durante cerca de 1 semana.Em seguida, o cérebro foi congelado e cortado em um criostato de 40 µm de espessura.As secções foram armazenadas sequencialmente em PBS a 10% a 4°C.Em seguida, a imunofluorescência foi realizada em seções flutuantes contendo a região cerebral de interesse.As secções foram lavadas 3 vezes em PBS a 10% durante 5 min cada.As secções foram então incubadas em solução bloqueadora de soro de cabra normal a 5% durante 2 horas à temperatura ambiente e depois lavadas mais três vezes durante 5 minutos cada em PBS a 10%.As seções foram então incubadas durante a noite a 4°C em anticorpos primários (c-Fos, #2250, 1:500) (Cell Signaling, Danvers, MA) diluídos em 1% de BSA em 10% de PBS.No dia seguinte, as secções foram lavadas em PBS a 10% durante 30 min a 4°C, depois 3 vezes durante 5 min em PBS a 10% e incubadas com um anticorpo secundário (Alexa Fluor 594 cabra anti-coelho, conjugado vermelho, 1:500 ).) (Invitrogen, Carlsbad, CA) à temperatura ambiente durante 2 horas.Após 3 lavagens adicionais em PBS a 10% durante 5 minutos, os cortes foram colocados em lâminas de vidro e selados com Fluoromount-G (Invitrogen).Veja imagens representativas da imunocoloração na Figura 3G.
Um microscópio fluorescente usando uma câmera digital Infinity3 (Lumenera, Ottawa, Ontário, Canadá) e um motor de luz (Lumencor, Beaverton, OR) conectado a um microscópio Zeiss foi usado para adquirir imagens de cada região do cérebro de interesse, incluindo seções contendo IL sem imunofluorescência.realizada para confirmar o posicionamento correto do local da injeção.As imagens utilizadas para contagem de células foram obtidas com ampliação de 20x.Para cada seção de tecido, tire uma imagem com um filtro que permite a visualização de GFP e uma imagem com um filtro que permite a visualização do conjugado vermelho Alexa Fluor no anticorpo secundário, e o software de imagem (Infinity Analyze, versão 3) foi usado para imagem sobreposição.Adquira todas as imagens de todas as áreas do cérebro usando o mesmo tempo de exposição e configurações de ganho.Seis ratos foram excluídos da análise porque a principal transmissão do vírus ocorreu fora da TI (taxa de acerto de 88%).Mais oito ratos foram excluídos porque, apesar do vírus atacar a IL, eles não mostraram expressão suficiente de GFP em todas as regiões cerebrais alvo de interesse.Além disso, um rato foi excluído devido à má qualidade do tecido.
Ajuste o brilho e o contraste para reduzir o ruído de fundo na imagem J (NIH) usando o mesmo procedimento para cada imagem.As contagens de células para o total de células marcadas retrógradas, o total de células marcadas com Fos e o total de células duplamente marcadas foram realizadas manualmente pelo experimentador, que não identificou os animais, utilizando o plug-in do citômetro Image J.As contagens de células foram normalizadas para células/mm2.Para analisar a expressão de Fos em células que projetam IL, o número de células duplamente marcadas foi normalizado para o número total de células marcadas retrógradas.Para análise de mBLA, mvHPC e pvHPC, as contagens de células de múltiplas imagens 20x foram somadas e normalizadas para células/mm2.Para análise do restante das regiões cerebrais, uma imagem 20x ou uma porção de uma imagem 20x foi analisada e normalizada para células/mm2.A análise vHPC incluiu regiões CA1, CA2 e vHPC subdominantes.A Figura 1 mostra as regiões cerebrais analisadas com imagens delineando a borda ântero-posterior do plano.
Abreviaturas e localização de regiões cerebrais de interesse.Explicação das abreviaturas e localizações das regiões do cérebro fornecidas no manuscrito.Mapa cerebral de domínio público retirado de Swanson (2004) Brain Map: Structure of the Rat Brain, 3rd Edition, licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/ 4.0) ./), disponível para download em https://larrywswanson.com.
A porcentagem do tempo de congelamento é calculada em média durante um período de reprodução de tom de 30 segundos, excluindo intervalos intermediários.As taxas de recuperação de extinção foram calculadas expressando a porcentagem de tempo de desvanecimento durante a recuperação de extinção como a porcentagem de desvanecimento durante os primeiros 4 testes de treinamento de extinção (desvanecimento durante quatro tons de recuperação de extinção/desbotamento durante os primeiros quatro tons de treinamento de extinção * 100).Pontuações baixas indicam boa memória de fade e pontuações altas indicam memória de fade fraca.Os ratos foram classificados por pontuação de recordação de extinção, com os ratos no terço superior da pontuação de recordação de extinção classificados como “ratos de extinção ruins” e os ratos nos últimos dois terços da pontuação de recordação de extinção foram classificados como “bons”.Ratos com memória apagada.
Testes não paramétricos são usados ​​porque os dados muitas vezes violam suposições sobre distribuição normal e/ou homogeneidade de variâncias.A correlação de postos de Spearman foi usada para determinar se havia uma associação significativa entre os escores de recordação de extinção e marcadores Fos e marcadores duplos em regiões cerebrais de interesse em todos os ratos submetidos ao teste de recordação de extinção.O teste U de Mann-Whitney foi utilizado para determinar se havia diferença entre dois grupos independentes.O teste de Kruskal-Wallis é usado para determinar se 2 ou mais grupos diferem entre si, e o teste de comparações múltiplas de Dunn é usado quando a estatística de Kruskal-Wallis é significativa.O desvanecimento durante a aprendizagem da extinção foi avaliado usando análise de variância de medidas repetidas com o grupo como fator intersujeito e o teste como fator intrassujeito. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05 para todos os testes estatísticos. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05 para todos os testes estatísticos. Результаты считались значимыми при p < 0,05 para seus testes estatísticos. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05 para todos os testes estatísticos.当所有统计检验的p < 0,05 时，结果被认为是显着的。当所有统计检验的p < 0,05 时，结果被认为是显着的。 Результаты считались значимыми при p < 0,05 para seus testes estatísticos. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05 para todos os testes estatísticos.
A Figura 2 mostra a linha do tempo experimental (Figura 2A) e a distribuição de frequência de todos os ratos submetidos à extinção (Figura 2B). Os ratos nos grupos de extinção boa e ruim diferiram significativamente nesses escores calculados de recordação de extinção (U = 0, p <0,001) (Fig. 2C). Os ratos nos grupos de extinção boa e ruim diferiram significativamente nesses escores calculados de recordação de extinção (U = 0, p <0,001) (Fig. 2C). Крысы в ​​​​группах с хорошим и плохим угашением значительно различались по этим рассчитанным показателям ния угашения (U = 0, p <0,001) (рис. 2C). Os ratos nos grupos de extinção boa e ruim diferiram significativamente nessas taxas calculadas de recuperação de extinção (U = 0, p <0,001) (Figura 2C).U = 0, p <0,001) ）。 U = 0,p <0,001）（图2C, Em этих рассчитанных показателях припоминания угашения крысы в ​​​​группах с хорошим и плохим угашением não различались (U = 0, p <0,001) (рис. 2C). Nessas taxas de recuperação de extinção calculadas, os ratos nos grupos de extinção boa e ruim diferiram significativamente (U = 0, p <0,001) (Figura 2C).Não houve diferença significativa no tempo de congelamento entre os grupos com boa extinção, má extinção e recordação do medo durante o período base da sessão de reflexo condicionado pelo medo (X2(2) = 2,746, p = 0,253) (Figura 2D).Além disso, durante a apresentação do primeiro tom do reflexo condicionado do medo, não houve diferença significativa no tempo de congelamento entre os grupos com boa extinção, má extinção e recordação do medo (X2(2) = 1,107, p = 0,575), pois bem como durante o medo durante os segundos tons.Durante a sessão de condicionamento, houve diferença significativa no tempo de congelamento entre os grupos com boa extinção, má extinção e recordação do medo (X2(2) = 2,214, p = 0,331) (Figura 2D).Também não houve diferença significativa no tempo de desvanecimento entre grupos de extinção bons e ruins durante o período de treinamento de extinção de linha de base (U = 45,00, p = 0,799) (Figura 2D). Em seguida, houve um efeito principal significativo do bloco de teste (5 tons por bloco) no tempo gasto no congelamento durante a sessão de treinamento de extinção (F (2,884, 54,80) = 8,331, p <0,001), indicando que ocorreu aprendizagem de extinção (Fig. 2D ). Em seguida, houve um efeito principal significativo do bloco de teste (5 tons por bloco) no tempo gasto no congelamento durante a sessão de treinamento de extinção (F (2,884, 54,80) = 8,331, p <0,001), indicando que ocorreu aprendizagem de extinção (Fig. 2D ). Defina o efeito desejado em um bloco (5 toneladas por bloco) no dia seguinte, zatraчиваемое на e em seu primeiro treinamento (F (2.884, 54.80) = 8.331, p <0,001), что указывает на то, что обучение угашению ( ris. 2D). Houve então um efeito principal significativo do bloco de teste (5 tons por bloco) no tempo necessário para congelar durante o treinamento de extinção (F (2,884, 54,80) = 8,331, p <0,001), indicando que o aprendizado de extinção estava ocorrendo (Fig. .2D). ).接下来，在消退训练期间，试块（每块5 音）对冻结时间有显着的主效应（F（2.884，54.80）=8.331，p < 0,001），表明发生了消退学习（图2D） ） 。接下来，在消退训练期间，试块（每块5 音）对冻结时间有显着的主效应（F（2.884，54.80）=8.331，p < 0,001），表明发生了消退学习（图2D） ） 。 Então, no final do dia, você pode usar blocos de papel (5 toneladas por bloco) para obter o máximo de brilho possível no verão замирания (F (2.884, 54,80) = 8.331, p <0,001), что указывает на то, что обучение угашению происходило (рис .2D). Então, durante a aprendizagem de extinção, os blocos de teste (5 tons por bloco) tiveram um efeito principal significativo no tempo de desvanecimento (F (2,884, 54,80) = 8,331, p <0,001), indicando que a aprendizagem de extinção estava ocorrendo (Fig. .2D) .No entanto, o grupo de extinção (F(1, 19) = 3,091, p = 0,095) não teve efeito significativo no tempo de desvanecimento ao longo do período de treinamento de extinção, e não houve interação entre o bloco experimental e o grupo de extinção (F(4 , 19)) .76) = 1,890, p = 0,121) (Fig. 2D). Durante a sessão de teste, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim e recordação do medo no tempo gasto no congelamento durante o período da linha de base (X2 (2) = 8,569, p = 0,014), de modo que o grupo de recordação do medo congelou significativamente. mais do que o grupo de boa extinção (Diferença de classificação média = 10,57, p = 0,017), mas não o grupo de extinção ruim (Diferença de classificação média = - 3,714, p> 0,999) (Fig. 2D). Durante a sessão de teste, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim e recordação do medo no tempo gasto no congelamento durante o período da linha de base (X2 (2) = 8,569, p = 0,014), de modo que o grupo de recordação do medo congelou significativamente. mais do que o grupo de boa extinção (Diferença de classificação média = 10,57, p = 0,017), mas não o grupo de extinção ruim (Diferença de classificação média = - 3,714, p> 0,999) (Fig. 2D).Durante a sessão de teste, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim e recordação de medo no tempo gasto no congelamento durante o período de referência (X2(2) = 8,569, p = 0,014), de modo que o grupo de recordação de medo congelou significativamente.mais, чем в группе хорошего вымирания (средняя разница рангов = 10,57, p = 0,017), mas não no grupo плохого вымирания ( средняя разница рангов = -3.714, p> 0.999) (рис. 2D). maior do que no grupo de boa extinção (diferença média de classificação = 10,57, p = 0,017), mas não no grupo de extinção ruim (diferença média de classificação = -3,714, p> 0,999) (Figura 2D).在测试期间，良好消退组、不良消退组和恐惧回忆组在基线期冻结时间方面存在显着差异（X2 (2) 8,569, p = 0,014), （平均秩差= 10,57，p = 0,017），但不是差的灭绝组（平均秩差= – 3,714，p > 0,999）（图2D）。在 测试 期间 , 良好 消退组 , 消 退组 和 恐惧 在 基线期 冻结 时间 方面 存在 显着 差异 （ （x2 (2) = 8,569 ， p = 0,014） ,组 组 组（平均秩差= 10,57，p = 0,017），但不是差绝组（平均秩差= – 3,714，p > 0,999）（图2D）。 No período de teste, o teste foi realizado com o grupo de interesse плохим угашением e группой com припоминанием страха с точки зрения времени замирания на исходном уровне (X2 (2) = 8.569, p = 0 ,014), поэтому припоминание страха группа замерзает значительно чаще , чем группа с хорошим вымиранием (средняя разница рангов = 10,57, p = 0,017), não не группа с плохим вымиранием (средняя раз ница рангов = -3.714, p> 0.999) (рис. 2D). Durante o período de teste, houve uma diferença significativa entre o grupo de boa extinção, o grupo de fraca extinção e o grupo de recordação do medo em termos de tempo de congelamento na linha de base (X2(2) = 8,569, p = 0,014), então a recordação do medo O grupo congela significativamente mais frequentemente do que o grupo com boa extinção (diferença média de classificação = 10,57, p = 0,017), mas não o grupo com extinção fraca (diferença média de classificação = -3,714, p > 0,999) (Figura 2D).O grupo de boa extinção, o grupo de baixa extinção e o grupo de recordação do medo também tiveram tempos de desvanecimento significativamente diferentes durante a apresentação do tom da sessão de teste (X2(2) = 14,93, p = 0,001), então o grupo de boa extinção teve significativamente menos tempo.tempo de congelamento do que no grupo de extinção fraca (diferença média de classificação = 9,286, p = 0,044) e no grupo de memória de medo (diferença média de classificação = 13,86, p = 0,001) (Fig. 2D).
Diferenças individuais na lembrança da extinção.(A) Esboço de procedimentos cirúrgicos e comportamentais.(B) Distribuição de frequência mostrando diferenças individuais nos escores de memória de desaparecimento.(C) Evidência de que grupos projetados com base em pontuações calculadas de recordação de extinção representam dois fenótipos diferentes.(D) Porcentagem média de tempo em que os ratos congelam para extinção ruim, extinção boa e recordação do medo em células de 30 segundos de uma sessão de reflexo de medo condicionado, em tons 20, 30 s, colapsados ​​em 5 blocos durante a sessão de aprendizagem de extinção (4 tons) .cada), e em quatro tons em sessões de memórias de desvanecimento e memórias de medo.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. *р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001, ****р < 0,0001. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. *p < 0,05,**p < 0,01,***p < 0,001,****p < 0,0001。 *p < 0,05,**p < 0,01,***p < 0,001,****p < 0,0001。 *р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001, ****р < 0,0001. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.
Um indicador retrógrado foi injetado no IL (Fig. 3A) e o número de células GFP+ ao longo do eixo ântero-posterior da região de interesse foi determinado (Fig. 3B-F).Houve uma diferença significativa no número de células GFP+ entre PVT anterior, médio e posterior (X2(2) = 8,200, p = 0,017), então mPVT mostrou significativamente mais células GFP+ do que aPVT (classificação média) Diff.= 18,37, p = 0,035) e pPVT (classificação média Diff. = 17,71, p = 0,045) (Fig. 3C).Embora vários animais não tenham detectado nenhuma célula GFP+ no pCLA e, portanto, não tenham conseguido mapear a atividade nesta região, não houve diferença significativa entre o CLA anterior, médio e posterior (X2(2) = 5,596, p = 0,061).Número de células GFP+(Figura 3D).Então, como algumas células GFP+ foram encontradas em aBLA ou avHPC em vários ratos, apenas o meio e o dorso dessas áreas foram analisados.O BLA médio e posterior (U=393, p=0,009) diferiram significativamente no número de células GFP+, então o pBLA apresentou mais projeções de IL do que o mBLA (Figura 3E).Da mesma forma, houve uma diferença significativa entre os vHPCs médios e posteriores, então os pvHPCs mostraram mais projeções de IL do que os mvHPCs (U = 403,5, p = 0,014) (Figura 3F).A Figura 3G é uma imagem exemplar que mostra Fos, aavRG-GFP e células duplamente marcadas.
Quantifique aferentes de IL em toda a região cerebral de interesse.(A) Representação esquemática da distribuição de aavRG-CAG-GFP em IL de rato inteiro.(B) Imagens representativas de marcadores retrógrados em diferentes locais ântero-posteriores na região cerebral de interesse.Quantificação da marcação retrógrada ao longo do eixo ântero-posterior (C) tálamo paraventricular, (D) clavícula, (E) tonsila basolateral e (F) hipocampo ventral.(G) Imagens representativas mostrando rotulagem aavRG retrógrada, rotulagem Fos e rotulagem dupla aavRG e Fos em aPVT.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05, **p < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01. *р < 0,05, **р < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01. *p < 0,05，**p < 0,01。 *p < 0,05，**p < 0,01。 *р < 0,05, **р < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01.Barra de escala 100 μm.O mapa cerebral de domínio público no painel A é reproduzido de Swanson (2004) Brain Map: Rat Brain Structure, 3rd Edition, licenciado sob a Creative Commons Attribution-NonCommons 4.0 International License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc )./4.0/) disponível para download em https://larrywswanson.com.
A atividade de Fos global e específica da projeção de IL foi analisada em aPVT, mPVT e pPVT em todos os ratos.Não houve diferença significativa entre boa extinção, má extinção, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em aPVT (X2 (3) = 3,888, p = 0,274) (Fig. 4A), nem houve uma correlação significativa entre Fos em aPVT entre expressão e recuperação de extinção (rs = 0,092, p = 0,691) (Figura 4B) ou entre expressão de Fos em aferentes de IL aPVT e recuperação de extinção (rs = 0,143, p = 0,537) (Figura 4D).No entanto, nos aferentes aPVT IL, a expressão de Fos diferiu significativamente entre boa extinção, fraca extinção, recordação do medo e grupos de células domésticas (X2 (3) = 15,05, p = 0,002), de modo que o grupo de recordação do medo apresentou extinção relativamente boa.grupos de regressão (diferença média de classificação = 11,54, p = 0,003), regressão pobre (diferença média de classificação = 10,57, p = 0,034) e células domésticas (diferença média de classificação = 12,79, p = 0,005) (Fig. 4C).Além disso, não houve diferença significativa entre boa extinção, má extinção, recordação do medo e grupos de células domésticas para expressão de Fos em mPVT (X2(3) = 2,272, p = 0,518) (Fig. 4E) e para expressão de Fos em mPVT..Correlação significativa com recordação de extinção (rs = 0,168 p = 0,468) (Figura 4F).Embora tenha havido uma diferença significativa entre os grupos bom, ruim, lembrança do medo e células domésticas na expressão de Fos em células mPVT aferentes de IL (X2 (3) = 9,252, p = 0,026), a comparação post hoc não revelou nenhum ou dois.Diferenças significativas entre os grupos (Figura 4G).Além disso, não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em células mPVT aferentes de IL e a recordação de extinção (rs = 0,174, p = 0,450) (Figura 4H). Em seguida, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e gaiola inicial na expressão de Fos no pPVT (X2 (3) = 13,89, p = 0,003), de modo que o grupo de boa extinção (Classificação Média Diff. = 14,96, p = 0,010), mas não o grupo de extinção pobre (Mean Rank Diff. = 12,86, p = 0,113) ou grupo de recordação de medo (Mean Rank Diff. = 2,571, p > 0,999), exibiu mais expressão de Fos do que o grupo. grupo de gaiola doméstica (Fig. 4I). Em seguida, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e gaiola inicial na expressão de Fos no pPVT (X2 (3) = 13,89, p = 0,003), de modo que o grupo de boa extinção (Classificação Média Diff. = 14,96, p = 0,010), mas não o grupo de extinção pobre (Mean Rank Diff. = 12,86, p = 0,113) ou grupo de recordação de medo (Mean Rank Diff. = 2,571, p > 0,999), exibiu mais expressão de Fos do que o grupo. grupo de gaiola doméstica (Fig. 4I). Dale, наблюдалась значительная разница между группами с хорошим угасанием, плохим угашением, отзывом страха e домашней клеткой em экспрессии Fos em pPVT (X2 (3) = 13,89, p = 0,003), então este grupo com хорошим угашением (средний ранг Dif. = 14,96, p = 0,010), não há valor no grupo (p = 0,113) ou grupos Na seção (средняя ранговая разница = 2.571, p > 0.999), демонстрировалась более выраженная экспрессия Fos, чем в группе группа домашних клеток (рис. 4I). Além disso, houve uma diferença significativa entre boa extinção, fraca extinção, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em pPVT (X2(3)=13,89, p=0,003), de modo que o grupo de boa extinção (classificação média Diff. = 14,96, p = 0,010), mas não no grupo de baixa extinção (diferença média de classificação = 12,86, p = 0,113) ou no grupo de memória de medo (diferença média de classificação = 2,571, p > 0,999), mostrou expressão de Fos mais pronunciada do que em o grupo de células domésticas (Figura 4I).其次 , ppvt 中 fos 表达 好 消 , 差消 , 恐惧 和 家笼组 之间 存在 显着 差异 （x2 （3） = 13,89 , p = 0,00 3） 使得 消组 （（média Rank Difff.= 14,96, p = 0,010)，但不是较差的消退(Diferença de classificação média = 12,86, p = 0,113) 或恐惧回忆组(Diferença de classificação média = 2,571, p > 0,999)，比家庭笼组（图4I ）。= 14,96, p = 0,010),但不是较差的消退(Diferença de classificação média = 12,86, p = 0,113) ）。Em segundo lugar, houve diferenças significativas na expressão de Fos em pPVT entre os grupos bom, ruim, recordação de medo e células domésticas (X2(3) = 13,89, p = 0,003), formando o grupo de boa ingestão (diferença média de classificação = 14,96)., p = 0,010), não не хуже по угашению (средняя разница рангов = 12,86, p = 0,113) ou группе отзыва страха (средняя разниц no grupo = 2.571, p > 0.999), no grupo de domínios (рис. 4I) . , p = 0,010), mas não pior em extinção (diferença média de classificação = 12,86, p = 0,113) ou grupo de recordação de medo (diferença média de classificação = 2,571, p > 0,999) do que o grupo de células domésticas (Figura 4I)..No entanto, não houve correlação significativa entre a expressão pPVT Fos e a recordação de extinção (rs = 0,051, p = 0,825) (Figura 4J).Finalmente, houve uma diferença significativa na expressão de Fos em aferentes de IL pPVT entre grupos com boa extinção, extinção ruim, memórias de medo e em células domésticas (X2(3) = 12,34 p = 0,006), então boa expressão de Fos em IL- foi pior do que nos grupos de extinção (diferença média de classificação = 12,54, p = 0,014) e na célula inicial (diferença média de classificação = 12,89, p = 0,049) (Fig. 4K) e significativamente correlacionada com aferentes de IL dentro de pPVT Entre ativação e revogação da extinção, melhor recordação da extinção foi associada a maior ativação desses aferentes de IL (rs = -0,438, p = 0,047) (Figura 4L).
A atividade de Fos foi aumentada nos aferentes IL do tálamo paraventricular posterior (PVT) em ratos, que apresentaram boa regressão.(A) Não houve diferenças significativas entre os grupos na expressão de Fos em aPVT.(B) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recordação de extinção em aPVT.(C) O grupo de recordação do medo apresentou expressão aumentada de Fos nos aferentes de IL em comparação com todos os outros grupos.(D) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recordação de extinção em aPVT.(E) Não houve diferenças significativas entre grupos na expressão de Fos em mPVT.(F) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a memória de extinção em mPVT.(G) A expressão de Fos em células IL aferentes em mPVT não diferiu significativamente entre os grupos.(H) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recordação de extinção em mPVT.(I) Um grupo bem extinto, mas nenhum outro grupo, apresentou atividade aumentada de Fos em pPVT em comparação com o grupo de gaiola.(J) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recordação de extinção em pPVT.(K) O grupo de boa extinção apresentou expressão aumentada de Fos nas células aferentes de IL em comparação com o grupo de extinção fraca e o grupo de células domésticas.(L) Existe uma correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recordação de extinção, portanto, uma boa recordação de extinção está associada a uma maior expressão de Fos em aferentes de IL.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05, **p < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01. *р < 0,05, **р < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01. *p < 0,05，**p < 0,01。 *p < 0,05，**p < 0,01。 *р < 0,05, **р < 0,01. *p < 0,05, **p < 0,01.
A atividade global e específica de projeção de IL em aCLA e mCLA de ratos foi então analisada em todos os grupos. Houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e gaiola inicial na expressão de Fos no aCLA (X2 (3) = 8,455, p = 0,036), de modo que o grupo de recordação de medo (Mean Rank Diff. = 14,50, p = 0,049), mas nem os grupos pobres (Mean Rank Diff. = 10,21, p = 0,373) nem boa extinção (Mean Rank Diff. = 4,607, p > 0,999) exibiram mais expressão de Fos do que o grupo da gaiola ( Figura 5A). Houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e gaiola inicial na expressão de Fos no aCLA (X2 (3) = 8,455, p = 0,036), de modo que o grupo de recordação de medo (Mean Rank Diff. = 14,50, p = 0,049), mas nem os grupos pobres (Mean Rank Diff. = 10,21, p = 0,373) nem boa extinção (Mean Rank Diff. = 4,607, p > 0,999) exibiram mais expressão de Fos do que o grupo da gaiola ( Figura 5A). Меж гbol пами с хорошим гшением, пллим гшениениен, припоиинvens иои пшрич ês Fos з з з з з з з з з э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э в в в (3) = 8.455, p = 0,036), та чч ч50505050505050505050505050505050505050505050 ns в ч т т т т т т т т т т т з т з.455, 0.036), т ч т т в в т в в 0.036). = 0,049) = 4.607, p > 0.999) não demonstrou maior expressão Fos, чем группа в домашней клетке ( Рис .5А). Houve uma diferença significativa na expressão de aCLA Fos entre os grupos de boa extinção, má extinção, recordação do medo e células domésticas (X2 (3) = 8,455, p = 0,036), de modo que o grupo de recordação do medo (diferença média de classificação = 14,50, p = 0,049), mas nem o grupo pobre (diferença média de classificação = 10,21, p = 0,373) nem o grupo de boa extinção (diferença média de classificação = 4,607, p> 0,999) mostraram mais expressão de Fos do que o grupo de células domésticas (Fig. .5A) . aCLA 中Fos 表达的良好消退、消退差、恐惧回忆和家庭笼组之间存在显着差异(X2 (3) = 8,455, p = 0,036),因此恐惧回忆组(Diferença de classificação média = 14,50，p = 0,049），但无论是差（平均秩差= 10,21，p = 0,373）还是良好灭绝（平均秩差= 4,607，p > 0,999）组，都显示出比家庭笼组更多的Fos 表达（图5A) 。 Acla 中 fos 表达 的 消退 、 消退差 、 回忆 和 家庭 笼组 之间 存在 显着 差异 差异 差异 差异 差异2 (3) = 8,455, p = 0,036) ， 因此 恐惧 回忆组 回忆组 回忆组 回忆组 (média Classificação Diff.秩差 秩差 = 4,607 ， p> 0,999） 组 都 出 比 家庭 笼组 更 多 的 表达 图 图 图 5a) 。 Você pode criar um grupo de pessoas com uma boa localização, construir uma casa, abrir uma rua e uma casa еткой по экспрессии Fos no aCLA (X2(3) = 8,455, p = 0,036), поэтому группа отзыва страха (среднее ранговое различие = 14,50) , p = 0,049), não há grupos no plano (número de escala = 10,21, p = 0,373) e valor de escala (número de escala = 4,60) 7, p > 0,999) показали более высокую экспрессию Fos, чем группа с домашней клеткой (рис. 5A). Houve uma diferença significativa entre boa extinção, extinção ruim, recordação do medo e grupos de células domésticas na expressão de aCLA Fos (X2(3) = 8,455, p = 0,036), então grupo de recordação do medo (diferença média de classificação = 14,50), p = 0,049 ), mas grupos com baixa (diferença média de classificação = 10,21, p = 0,373) e boa extinção (diferença média de classificação = 4,607, p> 0,999) apresentaram maior expressão de Fos do que o grupo de células domésticas (Fig. 5A). .Não houve correlação significativa entre a expressão global de Fos em (rs = 0,036, p = 0,876) (Figura 5B) ou expressão de Fos em células aferentes IL aCLA (rs = -0,282, p = 0,215) e recordação de extinção (Figura 5B)..5D), também não houve diferença significativa entre boa extinção, má extinção, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em aferentes de aCLA IL (X2(3) = 6,722, p = 0,081) (Figura 5C)..). Em seguida, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e gaiola inicial na expressão de Fos no mCLA (X2 (3) = 10,12, p = 0,018), de modo que o grupo de boa extinção (Mean Rank Diff . em relação ao grupo de gaiolas (Fig. 5E). Em seguida, houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e gaiola inicial na expressão de Fos no mCLA (X2 (3) = 10,12, p = 0,018), de modo que o grupo de boa extinção (Mean Rank Diff . em relação ao grupo de gaiolas (Fig. 5E). Затем наблюдалась значительная разница между группами с хорошим угашением, плохим угашением, воспоминаниями о страхе и домашней клеткой в ​​​​экспрессии Fos em mCLA (X2 (3) = 10,12, p = 0,018), então este grupo com хорошим угашением (средняя não рангов . страха (средняя ранговая разница = 14,00, p = 0,063) não é um valor maior экспрессии Fos no mCLA. Houve então uma diferença significativa entre boa extinção, extinção ruim, memórias de medo e grupos de células domésticas na expressão de mCLA Fos (X2(3) = 10,12, p = 0,018), de modo que o grupo de boa extinção (classificação de diferença média = 12,93, p = 0,038), mas nem os grupos de extinção pobre (diferença média de classificação = 5,143, p > 0,999) nem os grupos de recordação do medo (diferença média de classificação = 14,00, p = 0,063) mostraram expressão de Fos significativamente maior em mCLA.em comparação com o grupo de gaiola (Figura 5E).接下来, 在 mcla 中 的 fos 表达, 良好 消退组, 不良 消 退组, 恐惧 回忆组 家庭 笼组 之间 显着差异 （x2 （3） = 10,12 ， p = 0,018） ， 良好 （（（（（（ （（（ Diferença de classificação média.= 12,93; 3）均未显示出更多的Fos 表达相对于家庭笼组（图5E）。 = 12,93;秩差 = 14,00 ， p = 0,063） 未 显示 出 更 多 的fos 表达 表达 的 fos 表达 表达 的 fos 表达相对于家庭笼组（图5E）。 Dale, na seleção de Fos no mCLA, ​​você pode criar um grupo maior com seu grupo de trabalho, grupo no local хим угасанием, группой с отзывом о страхе и группой с домашней клеткой (X2(3) = 10,12, p = 0,018), так, хороше eu угашения (средняя разность рангов = 12,93, p = 0,038), não no mCLA ни слабое угасание (средняя разница рангов = 5,143, p > 0,999), ни группа отзыва страха (средняя разница рангов = 14,00, p = 0,999) = 0,063). Além disso, houve uma diferença significativa na expressão de Fos no mCLA entre o grupo de boa extinção, o grupo de fraca extinção, o grupo de feedback do medo e o grupo de células domésticas (X2(3) = 10,12, p = 0,018), portanto, o bom extinção (diferença média de classificação = 12,93, p = 0,038), mas no mCLA nem extinção fraca (diferença média de classificação = 5,143, p > 0,999) nem grupo de recordação de medo (diferença média de classificação = 14,00, p = 0,999) = 0,063) mostraram melhor Expressão Multi Fos em comparação com o grupo de células domésticas (Figura 5E).No entanto, a expressão global de Fos em mCLA (rs = 0,321, p = 0,156) (Fig. 5F) ou em células IL mCLA aferentes (rs = -0,121, p = 0,602) e recuperação de extinção (Fig. 5H), não há diferença significativa entre grupos com boa extinção, fraca extinção, recordação do medo e uma célula inicial para expressão de Fos em células aferentes de IL mCLA (X2(3)=4,923, p=0,178) (Figura 5G).
A atividade de Fos foi elevada no claustro médio em ratos com boa memória de extinção.(A) O grupo de recordação do medo, mas não os outros grupos, apresentou aumento da atividade Fos em comparação com o grupo de células domésticas no aCLA.(B) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos no aCLA e a recordação de extinção.(C) A expressão de Fos em células aCLA aferentes de IL não diferiu significativamente entre os grupos.(D) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recordação de extinção em aCLA.(E) O grupo bem extinto, mas não os outros grupos, apresentou aumento da atividade Fos no mCLA em comparação com o grupo de células domésticas.(F) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recordação de extinção no mCLA.(G) A expressão de Fos em células aferentes de IL mCLA não diferiu significativamente entre os grupos.(H) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recordação de extinção em mCLA.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05. *p < 0,05. *р < 0,05. *p < 0,05. *p < 0,05。 *p < 0,05。 *р < 0,05. *p < 0,05.
Em seguida, a atividade de Fos global e específica da projeção de IL em mBLA e pBLA foi analisada em todos os grupos de ratos.Não houve diferença significativa entre boa extinção, má extinção, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em mBLA (X2(3)=0,944, p=0,815) (Figura 6A).Também não houve diferença significativa entre grupos com boa regressão, regressão pobre, recordação de medo e expressão de Fos em células domésticas em células aferentes de IL mBLA (X2(3)=0,518, p=0,915) (Figura 6C).Além disso, não houve correlação significativa entre a expressão global de Fos em mBLA (rs = 0,126, p = 0,588) (Figura 6B) e a expressão de Fos em células aferentes de IL mBLA (rs = 0,200, p = 0,385) (rs = 0,200, p = 0,385).p = 0,385).Figura 6D) e recall de extinção.Também não houve diferença significativa em boa extinção, extinção deficiente, memória de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em pBLA (X2(3) = 4,246, p = 0,236) (Fig. 6E), e também não houve diferença significativa em pBLA Bom.extinção, extinção deficiente, recordação do medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em células aferentes de IL (X2(3)=1,954, p=0,582) (Figura 6G).Finalmente, expressão global de Fos em pBLA (rs = 0,070, p = 0,762) (Fig. 6F) e expressão de Fos em células aferentes de pBLA IL (rs = 0,122, p = 0,597) e recuperação de extinção (Fig. 6H).
As diferenças individuais na reprodução da extinção não foram mapeadas para diferenças na expressão de Fos na amígdala basolateral.(A) Não houve diferenças significativas entre grupos na expressão de Fos em mBLA.(B) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recordação de extinção em mBLA.(C) A expressão de Fos em células aferentes de IL mBLA não diferiu significativamente entre os grupos.(D) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em células aferentes de IL e a recuperação de extinção em mBLA.(E) Não houve diferenças significativas entre grupos na expressão de Fos em pBLA.(F) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recordação de extinção em pBLA.(G) A expressão de Fos em células IL pBLA aferentes não diferiu significativamente entre os grupos.(H) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em células aferentes de IL e a recuperação de extinção em pBLA.As barras de erro representam o desvio padrão da média.
Finalmente, a atividade de Fos global e específica da projeção de IL foi analisada em mvHPC e pvHPC em todos os ratos. Houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e gaiola inicial na expressão de Fos no mvHPC (X2 (3) = 8,056, p = 0,045), de modo que a boa extinção (Mean Rank Diff. = 13,29) , p = 0,031), mas nem os grupos de extinção pobre (Mean Rank Diff. = 6,857, p> 0,999) nem de recordação de medo (Mean Rank Diff. = 8,000, p = 0,864) mostraram mais expressão de Fos do que o grupo da gaiola doméstica (Fig. 7A). Houve uma diferença significativa entre os grupos de boa extinção, extinção ruim, recordação de medo e gaiola inicial na expressão de Fos no mvHPC (X2 (3) = 8,056, p = 0,045), de modo que a boa extinção (Mean Rank Diff. = 13,29) , p = 0,031), mas nem os grupos de extinção pobre (Mean Rank Diff. = 6,857, p> 0,999) nem de recordação de medo (Mean Rank Diff. = 8,000, p = 0,864) mostraram mais expressão de Fos do que o grupo da gaiola doméstica (Fig. 7A). Um grande grupo com um grande número de pessoas, um plano de trabalho, uma estrada e uma casa fechadas ьная разница в экспрессии Fos в mvHPC (X2 (3) = 8,056, p = 0,045), так что хорошее угасание (средняя ранговая разница = 13,29) = 0,031), não ни в группах с плохим угасанием (средняя ранговая разница = 6,857, p > 0,999), ни в групе с отзывом страха (с редняя ранговая разница = 8.000, p = 0.864) экспрессия Fos была выше, чем в группе с домашней клеткой (ris. 7А). Houve uma diferença significativa na expressão de mvHPC Fos entre grupos com boa extinção, fraca extinção, recordação de medo e células domésticas (X2(3) = 8,056, p = 0,045), portanto boa extinção (diferença média de classificação = 13,29), p = 0,031), mas nem no grupo de extinção pobre (diferença média de classificação = 6,857, p > 0,999) nem no grupo de recordação do medo (diferença média de classificação = 8,000, p = 0,864) a expressão de Fos foi maior do que no grupo inicial.célula (Fig. 7A). mvHPC 中Fos 表达的良好消退、不良消退、恐惧回忆和家庭笼组之间存在显着差异（X2 (3) = 8,056, p = 0,045 ），因此良好消退（平均秩差= 13,29） ，p = 0,031 ），但无论是弱消退（平均秩差= 6,857，p > 0,999）还是恐惧回忆（平均秩差= 8,000，p = 0,864）组都显示出比家庭笼组更多的Fos 表达（图2）。 mvhpc 中 fos 表达 的 消退 、 不良 消退 恐惧 回忆 和 家庭 笼组 之间 存在 显着 差异 （（x2 (3) = 8.056 , p = 0,045） ， 良好 ((平均 秩差 秩差 = 13,29) p = 0,031 ） , 但 无论是 弱消退 （平均 秩差 秩差 = 6,857 ， p> 0,999） 还是 恐惧 （平均 秩差 秩差 = 8,000 ， p = 0,8 64） 组都 出 家庭 笼组 多 的 fos 表达 图 图。。。。 ））））））））））））））））））））））））））））））））））） Имелась значительная разница между группами «хорошо», «плохо», «припоминание страха» e «домашняя клетка» para экспресси e Fos em mvHPC (X2(3) = 8.056, p = 0.045) e, следовательно, хорошая регрессия (средняя разница рангов = 13,29), p = 0,031), não há grupos que sejam iguais (средняя разница рангов = 6,857, p > 0,999) e воспоминания о страхе (средняя ра зница рангов = 8.000, p = 0.864) показали более высокую экспрессию Fos, чем группа в домашней клетке (ris. 2). Houve uma diferença significativa entre os grupos bom, ruim, recordação de medo e células domésticas para expressão de Fos em mvHPC (X2(3) = 8,056, p = 0,045) e, portanto, uma boa regressão (diferença média de classificação = 13,29), p = 0,031), mas grupos com extinção fraca (diferença média de classificação = 6,857, p> 0,999) e memórias de medo (diferença média de classificação = 8,000, p = 0,864) apresentaram maior expressão de Fos do que o grupo em gaiola (Fig. 2).7A).Porém, não houve diferença significativa (X2(3) = 4,893, p = 0,180) (Figura 7C).Além disso, não houve correlação significativa entre a expressão global de Fos em mvHPC (rs = -0,233, p = 0,309) (Figura 7B) e a expressão de Fos em células IL aferentes de mvHPC (rs = 0,056, p = 0,810) (Figura 7D).e um relatório sobre o desaparecimento.Além disso, não houve diferença significativa entre boa extinção, má extinção, recordação de medo e grupos de células domésticas na expressão de Fos em pvHPC (X2(3) = 3,623, p = 0,353) (Figura 7E), e não houve diferenças significativas.diferença na boa regressão da expressão de Fos em células IL aferentes de pvHPC, regressão fraca, memória de medo e grupos de células domésticas (X2 (3) = 3,871, p = 0,276) (Fig. 7G).Finalmente, não houve correlação significativa entre a expressão global de Fos de pvHPC (rs = -0,127, p = 0,584) (Figura 7F) e a expressão de Fos em células pvHPC aferentes de IL (rs = 0,176, p = 0,447) e recuperação de extinção (Figura 7F ).7H).
A expressão de Fos está elevada no hipocampo ventral de ratos, indicando boa extinção da memória.(A) O grupo bem extinto, mas não os outros grupos, apresentou expressão aumentada de Fos em mvHPC em comparação com o grupo de células domésticas.(B) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recordação de extinção em mvPHC.(C) A expressão de Fos em células IL aferentes de mvHPC não diferiu significativamente entre os grupos.(D) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recuperação de extinção em mvHPC.(E) Não houve diferenças significativas entre os grupos na expressão de Fos em pvHPC.(F) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos e a recordação de extinção em pvHPC.(G) A expressão de Fos em células IL aferentes pVHPC não diferiu significativamente entre os grupos.(H) Não houve correlação significativa entre a expressão de Fos em aferentes de IL e a recordação de extinção em pvHPC.As barras de erro representam o desvio padrão da média. *p < 0,05. *p < 0,05. *р < 0,05. *p < 0,05. *p < 0,05。 *p < 0,05。 *р < 0,05. *p < 0,05.Nossa análise primária para todas as regiões mostrou comparação em três níveis ao longo do eixo ântero-posterior, embora também tenhamos analisado cada região que colapsou ao longo do eixo ântero-posterior.Os resultados dessas análises são apresentados na tabela 1.
Aqui testamos se as diferenças individuais na recordação da extinção seriam refletidas em diferentes padrões de atividade aferente no córtex límbico inferior.Para tanto, avaliamos a atividade de Fos nas projeções de IL do tálamo paraventricular, claustro, tonsila basolateral e hipocampo ventral após repetição de extinção.Nas células que projetam IL, encontramos maior atividade na região posterior da PVT em ratos que exibiram boa recordação de extinção em comparação com ratos com fraca extinção.Não houve diferenças nos aferentes de IL do núcleo clavicular, hipocampo ventral ou tonsila basolateral.Além das células que projetam IL, foi observado aumento da atividade neural em áreas selecionadas do claustro do rato e do hipocampo ventral com boa resolução.Nossos resultados indicam que a memória de extinção bem-sucedida é organizada por projeções específicas de PVT para células alvo de IL e não-IL no claustro e no hipocampo ventral.
Descobrimos que a previsão de PVT IL estava ativa em ratos que apresentavam boa recordação de extinção, o que é consistente com um estudo recente mostrando que o PVT é necessário para a recordação de extinção.Este estudo não utilizou manipulações específicas da sub-região, mas mostrou que tanto as projeções PVT na amígdala central lateral quanto as projeções IL no PVT eram necessárias para reproduzir a extinção.Nossos resultados indicam que, além da cadeia IL-PVT-CeL, uma entrada pós-PVT na IL também pode ser necessária para a recuperação da extinção.Assim, verifica-se que tanto as conexões IL eferentes quanto as aferentes estão envolvidas na reprodução da extinção.Um próximo passo importante é determinar o que faz com que o pPVT sinalize a reprodução da extinção no nível do circuito neural.Além da relação com IL, estudos anteriores de rastreamento de ductos31,32 mostraram que o pPVT recebe informações da substância cinzenta periaquedutal ventral (vPAG), que está associada ao aprendizado de extinção33,34,35,36.Embora o papel do vPAG na recordação da extinção não tenha sido estabelecido, a predição do pPVT pelo vPAG é um candidato atraente devido à sua densidade e ao envolvimento de ambas as regiões na geração de evidências prévias de extinção do medo.
Outro aspecto importante dos nossos resultados de PVT é que eles são especializados ao longo do seu eixo ântero-posterior.Surpreendentemente, a atividade neuronal da projeção PVT em IL correlaciona-se com o estado comportamental oposto, de modo que a atividade de projeção pré-PVT em IL está associada à recordação do medo, enquanto a projeção pPVT está ativa após a extinção bem-sucedida da recordação (isto é, medo).Esta heterogeneidade funcional dentro do PVT não é surpreendente, dado o trabalho anterior [discutido em 37].Um exemplo notável de distribuição funcional na TVP surgiu recentemente em um estudo que caracterizou as propriedades de tipos celulares específicos na TVP.Este estudo mostra que as células de dopamina que expressam DRD2 são predominantemente expressas em pPVT, inervam o córtex do membro anterior e respondem a estímulos aversivos.A segunda população celular é predominantemente expressa em aPVT e marca a transição para um estado de baixa excitação fisiológica e inerva o córtex dos membros inferiores.Nossos resultados dificilmente se enquadram nesse padrão, já que as células aPVT que projetam IL estão ativas durante a recordação do medo, enquanto as projeções pPVT estão ativas e os animais apresentam baixos níveis de medo.Existem pelo menos duas explicações possíveis para a aparente discrepância.Primeiro, os tipos de células identificados não estão localizados exclusivamente em um sítio ântero-posterior do TVV.Assim, células pPVT ativas que projetam IL em ratos com boa memória de extinção podem pertencer a uma classe de células que têm maior probabilidade de serem detectadas em aPVT e sinalizam uma transição para um estado de baixa excitação.O mesmo pode ser verdade para células que projetam IL em aPVT ativadas após memória de medo.Em segundo lugar, estudos de rastreamento anteriores identificaram a presença de pPVTs que projetam IL3, embora alguns pareçam ser derivados de células contendo DRD2, outros tipos de células podem projetar-se para IL e tornar-se ativados após a reprodução bem-sucedida da extinção.
Embora o objetivo deste estudo fosse identificar diferenças entre ratos exibindo diferentes fenótipos de extinção, esses experimentos também revelaram novos dados relacionados aos mecanismos de memória do medo.Curiosamente, encontramos aumento da atividade Fos no CLA anterior em ratos com memória de medo.
A clavícula posiciona-se como centro da comunicação cortical e está envolvida em processos que vão desde a integração sensorial até a atenção e o sono40,41,42,43.Há evidências limitadas sobre como o claustro está envolvido no condicionamento do medo ou na expressão do medo; no entanto, pesquisas anteriores mostraram que a expressão contextual do medo está envolvida na atividade de Fos no claustro.Foi recentemente relatado que a inibição das projeções de atresia para o córtex entorrinal durante o condicionamento contextual do medo prejudica a formação da memória de longo prazo, embora a sua necessidade de expressão do medo não tenha sido testada.No mesmo estudo, foi observado aumento da ativação de Fos quando os animais foram expostos a um novo ambiente em comparação com ratos expostos a um ambiente familiar.Com isto em mente, a ativação do CLA que relatamos aqui pode ser devida à exposição à nova câmera durante os testes, e não ao medo do recall em si.Para caracterizar com mais precisão a função dos bloqueios no medo e no processamento situacional, estudos futuros devem usar a manipulação direcionada dos bloqueios.
Embora trabalhos anteriores tenham mostrado que a TVP está associada à expressão da memória do medo,45,46,47 não observamos nenhuma alteração na expressão total de Fos em ratos quando eles recordaram o medo 48 horas após o condicionamento.Esta diferença pode ser explicada por vários factores, incluindo trabalhos anteriores que testaram o medo de sinais discretos no mesmo contexto em que o condicionamento ocorreu, enquanto na nossa experiência, o teste foi feito numa nova sala.Além disso, sacrificamos nossos animais 60 minutos após o teste, enquanto o trabalho anterior utilizou um tempo de 90 minutos.Finalmente, em estudos anteriores, o teste foi realizado numa sala onde os animais podiam responder com apetite, enquanto no nosso trabalho os ratos foram testados sem resposta de apetite.Embora isso permita algum grau de inibição condicionada, há evidências de que permitir que os animais inibam a pressão para obter comida enquanto testam se eles temem sinais cria conflito motivacional (isto é, medo versus recompensa), que é um fator estimulante chave.participação PVT48, 49. .
Sabe-se que a amígdala basolateral está envolvida na aquisição da extinção do medo50,51 e há evidências de que as projeções do BLA para IL também estão envolvidas nesse processo23.No entanto, não está claro se o BLA e suas conexões estão envolvidos no retorno da extinção.Estudos de imagem23,28 mostraram aumento da atividade do BLA em animais que recordam memórias desbotadas.Embora nosso trabalho anterior não tenha mostrado nenhuma diferença na ativação do BLA entre ratos com extinção boa e ruim, nossos resultados aqui sugerem que a recordação da extinção geralmente não afeta o BLA ou a ativação na previsão do BLA IL.Consistente com nossas descobertas, embora estudos de manipulação de circuitos sugiram que as entradas de IL para o BLA sejam importantes para o aprendizado da extinção, elas não são necessárias para a recuperação da extinção.No entanto, o papel do BLA não pode ser completamente ignorado, uma vez que evidências recentes sugerem que certos tipos de células no BLA são necessários para reproduzir a extinção.
Notavelmente, a recordação do medo não resultou na ativação de Fos no BLA, uma vez que lesões anteriores, medicamentos e estudos de imagem implicaram esta área na expressão do medo e/ou na reconsolidação do medo após a recuperação54,55,56,57.Os dados aqui apresentados combinam o subnúcleo basal e lateral da amígdala, e dados anteriores sugerem que a expressão do medo impulsiona a atividade de Fos no lado dorsal do núcleo lateral.Analisamos os dados subjacentes e laterais separadamente, mas não houve diferença em nenhum dos casos (dados não mostrados) e ambas as áreas entraram em colapso nos dados que apresentamos aqui.Não analisamos sub-regiões da amígdala lateral, portanto alterações específicas nesta área podem ser mascaradas.Outra possibilidade de não haver alteração na atividade de Fos no BLA é devido ao tempo das memórias de medo em comparação com o condicionamento.Alguns trabalhos anteriores mostraram que a contribuição do BLA para a expressão do medo diminui com o tempo após o condicionamento, de modo que a expressão é dependente do BLA 24 horas após o condicionamento, mas independente aos 7 dias (ref. 45, mas ver 58).ocorreu 48 horas após o treinamento, fazendo com que a falta de mudança na atividade de Fos neste momento provavelmente refletisse mudanças dependentes do tempo na participação do BLA na expressão do medo.
Finalmente, encontramos evidências de que a memória de extinção bem-sucedida está associada ao hipocampo ventral.Isto é característico dos vHPCs “intermediários”, pois o mesmo padrão não foi observado na região posterior.Consistente com trabalhos anteriores, não encontramos nenhuma alteração na ativação de Fos em ILs vHPC aferentes.Há evidências substanciais de que o vHPC28,60,61 é necessário para a atualização do medo quando o CS ocorre fora do contexto em que ocorre o desvanecimento, e que isso depende, pelo menos em parte, da entrada do vHPC na IL13.Com base nestes resultados anteriores, esperaríamos que o desvanecimento deficiente estivesse associado ao aumento da atividade prevista de IL do vHPC.No entanto, este não foi o caso, uma vez que não houve diferença na atividade de Fos em vHPCs marcados retrógrados projetados com IL ou células não marcadas em vHPCs.Isto sugere que a incapacidade de lembrar o desvanecimento no contexto do desvanecimento pode desencadear um mecanismo diferente do medo da renovação.
É importante observar algumas das limitações inerentes ao projeto e à análise e como elas afetam nossas conclusões.Primeiro, dividimos os animais em terços superiores e inferiores, e os ratos em “bons” e “maus” com base nas pontuações de recordação de extinção.Isto é feito para evitar esquemas de grupos que dividam os animais em grupos separados a partir do meio da distribuição, ou esquemas de grupos que excluam animais do meio da distribuição, como a separação por mediana ou a comparação dos terços superior e inferior dos ratos. .queremos evitar esta situação porque a divisão mediana não reflete a variabilidade das respostas humanas ao trauma que estamos tentando modelar.Além disso, embora a comparação dos terços superior e inferior dos ratos nos permita comparar grupos de tamanho semelhante, esta abordagem ignora os animais no centro da distribuição e não reflete com precisão a variabilidade nas reações à lesão.Embora nosso método possa sofrer de problemas com variância heterogênea e comparação de grupos com tamanhos amostrais desiguais, ele captura melhor o que estamos tentando imitar do que métodos alternativos.
Os resultados apresentados aqui nos ajudam a entender melhor como as diferenças individuais na recordação da extinção se refletem nas diferenças na atividade do circuito neural.Nossas descobertas podem ser relevantes para o transtorno de estresse pós-traumático, que é conhecido por estar associado ao medo excessivo e à incapacidade de eliminar as respostas de medo.Mostramos que as diferenças na recordação da extinção estão associadas a diferenças na atividade neural intrínseca e extrínseca projetada na IL.Essas diferenças foram distribuídas por regiões distintas ao longo do eixo ântero-posterior, destacando ainda mais a importância da avaliação da função cerebral em nível sub-regional.As desvantagens do método atual incluem a relevância do estudo e o foco em roedores machos.Pesquisas futuras devem determinar os mecanismos neurobiológicos subjacentes ao aprendizado da extinção em roedores fêmeas e usar métodos para fazer inferências causais.
Os conjuntos de dados utilizados e/ou analisados ​​no presente estudo estão disponíveis aos respectivos autores mediante solicitação razoável.
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