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Os vetores genéticos para o tratamento da fibrose cística pulmonar devem ser direcionados às vias aéreas condutoras, uma vez que a transdução pulmonar periférica não tem efeito terapêutico.A eficiência da transdução viral está diretamente relacionada ao tempo de residência do portador.No entanto, os fluidos de entrega, como os transportadores de genes, difundem-se naturalmente nos alvéolos durante a inalação, e as partículas terapêuticas de qualquer formato são rapidamente removidas pelo transporte mucociliar.Prolongar o tempo de residência dos portadores de genes no trato respiratório é importante, mas difícil de conseguir.Partículas magnéticas conjugadas com transportadores que podem ser direcionadas para a superfície do trato respiratório podem melhorar o direcionamento regional.Devido a problemas com imagens in vivo, o comportamento dessas pequenas partículas magnéticas na superfície das vias aéreas na presença de um campo magnético aplicado é pouco compreendido.O objetivo deste estudo foi utilizar imagens síncrotron para visualizar in vivo o movimento de uma série de partículas magnéticas na traquéia de ratos anestesiados, a fim de estudar a dinâmica e os padrões de comportamento de partículas únicas e volumosas in vivo.Em seguida, avaliamos também se a entrega de partículas magnéticas lentivirais na presença de um campo magnético aumentaria a eficiência da transdução na traqueia de ratos.A imagem de raios X síncrotron mostra o comportamento de partículas magnéticas em campos magnéticos estacionários e em movimento in vitro e in vivo.As partículas não podem ser facilmente arrastadas pela superfície das vias aéreas vivas usando ímãs, mas durante o transporte, os depósitos concentram-se no campo de visão, onde o campo magnético é mais forte.A eficiência da transdução também aumentou seis vezes quando partículas magnéticas lentivirais foram entregues na presença de um campo magnético.Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que as partículas magnéticas lentivirais e os campos magnéticos podem ser abordagens valiosas para melhorar o direcionamento do vetor genético e os níveis de transdução nas vias aéreas condutoras in vivo.
A fibrose cística (FC) é causada por variações em um único gene denominado regulador de condutância transmembrana da FC (CFTR).A proteína CFTR é um canal iônico que está presente em muitas células epiteliais por todo o corpo, incluindo as vias aéreas, um local importante na patogênese da fibrose cística.Defeitos no CFTR levam ao transporte anormal de água, desidratação da superfície das vias aéreas e diminuição da profundidade da camada fluida da superfície das vias aéreas (ASL).Também prejudica a capacidade do sistema de transporte mucociliar (MCT) de limpar as vias aéreas de partículas e patógenos inalados.Nosso objetivo é desenvolver uma terapia genética lentiviral (LV) para entregar a cópia correta do gene CFTR e melhorar ASL, MCT e saúde pulmonar, e continuar desenvolvendo novas tecnologias que possam medir esses parâmetros in vivo1.
Os vetores do VE são um dos principais candidatos à terapia genética da fibrose cística, principalmente porque podem integrar permanentemente o gene terapêutico nas células basais das vias aéreas (células-tronco das vias aéreas).Isto é importante porque eles podem restaurar a hidratação normal e a eliminação do muco, diferenciando-se em células funcionais da superfície das vias aéreas, corrigidas por genes, associadas à fibrose cística, resultando em benefícios para a vida toda.Os vetores do VE devem ser direcionados contra as vias aéreas condutoras, pois é aqui que começa o envolvimento pulmonar na FC.A entrega do vetor mais profundamente no pulmão pode resultar em transdução alveolar, mas isto não tem efeito terapêutico na fibrose cística.No entanto, fluidos como os portadores de genes migram naturalmente para os alvéolos quando inalados após o parto3,4 e as partículas terapêuticas são rapidamente expelidas para a cavidade oral pelos MCTs.A eficiência da transdução do VE está diretamente relacionada ao período de tempo que o vetor permanece próximo às células-alvo para permitir a captação celular – “tempo de residência” 5 que é facilmente encurtado pelo fluxo de ar regional típico, bem como pela captação coordenada de muco e partículas de MCT.Para a fibrose cística, a capacidade de prolongar o tempo de residência do VE nas vias aéreas é importante para atingir altos níveis de transdução nesta área, mas até agora tem sido um desafio.
Para superar esse obstáculo, propomos que as partículas magnéticas (MPs) de LV podem ajudar de duas maneiras complementares.Primeiro, eles podem ser guiados por um ímã até a superfície das vias aéreas para melhorar o direcionamento e ajudar as partículas transportadoras de genes a estarem na área correta das vias aéreas;e ASL) movem-se para a camada celular 6. Os MPs são amplamente utilizados como veículos de entrega de medicamentos direcionados quando se ligam a anticorpos, medicamentos quimioterápicos ou outras moléculas pequenas que se ligam às membranas celulares ou se ligam aos seus respectivos receptores de superfície celular e se acumulam em locais tumorais em presença de eletricidade estática.Campos magnéticos para terapia do cancro 7. Outros métodos “hipertérmicos” visam matar células tumorais aquecendo MPs quando expostos a campos magnéticos oscilantes.O princípio da transfecção magnética, no qual um campo magnético é usado como agente de transfecção para aumentar a transferência de DNA para as células, é comumente usado in vitro usando uma variedade de vetores de genes virais e não virais para linhas celulares difíceis de transduzir. ..A eficiência da magnetotransfecção do VE com a entrega de MP do VE in vitro em uma linha celular de epitélio brônquico humano na presença de um campo magnético estático foi estabelecida, aumentando a eficiência da transdução em 186 vezes em comparação com o vetor do VE sozinho.A MT do VE também foi aplicada a um modelo in vitro de fibrose cística, onde a transfecção magnética aumentou a transdução do VE em culturas de interface ar-líquido por um fator de 20 na presença de escarro de fibrose cística10.No entanto, a magnetotransfecção de órgãos in vivo recebeu relativamente pouca atenção e só foi avaliada em alguns estudos em animais11,12,13,14,15, especialmente nos pulmões16,17.Contudo, as possibilidades de transfecção magnética na terapia pulmonar na fibrose cística são claras.Tan et al.(2020) afirmaram que “um estudo de validação sobre a distribuição pulmonar eficaz de nanopartículas magnéticas abrirá caminho para futuras estratégias de inalação de CFTR para melhorar os resultados clínicos em pacientes com fibrose cística”6.
O comportamento de pequenas partículas magnéticas na superfície do trato respiratório na presença de um campo magnético aplicado é difícil de visualizar e estudar e, portanto, é pouco compreendido.Em outros estudos, desenvolvemos um método de imagem de raios-X com contraste de fase baseado em propagação síncrotron (PB-PCXI) para imagens não invasivas e quantificação de pequenas alterações in vivo na profundidade ASL18 e no comportamento MCT19,20 para medir diretamente a hidratação da superfície do canal de gás e é usado como um indicador precoce da eficácia do tratamento.Além disso, nosso método de pontuação MCT utiliza partículas de 10 a 35 µm de diâmetro compostas de alumina ou vidro de alto índice de refração como marcadores MCT visíveis com PB-PCXI21.Ambos os métodos são adequados para gerar imagens de uma variedade de tipos de partículas, incluindo MPs.
Devido à alta resolução espacial e temporal, nossos ensaios ASL e MCT baseados em PB-PCXI são adequados para estudar a dinâmica e os padrões comportamentais de partículas únicas e em massa in vivo para nos ajudar a compreender e otimizar os métodos de entrega do gene MP.A abordagem que usamos aqui é baseada em nossos estudos usando a linha de luz SPring-8 BL20B2, na qual visualizamos o movimento do fluido após a entrega de uma dose de um vetor fictício nas vias aéreas nasais e pulmonares de camundongos para ajudar a explicar nossos padrões heterogêneos de expressão gênica observados em nosso gene.estudos em animais com uma dose transportadora de 3,4.
O objetivo deste estudo foi utilizar o síncrotron PB-PCXI para visualizar movimentos in vivo de uma série de MPs na traquéia de ratos vivos.Esses estudos de imagem PB-PCXI foram projetados para testar a série MP, a intensidade do campo magnético e a localização para determinar seu efeito no movimento do MP.Assumimos que um campo magnético externo ajudaria o MF entregue a permanecer ou mover-se para a área alvo.Esses estudos também nos permitiram determinar configurações magnéticas que maximizam a quantidade de partículas deixadas na traqueia após a deposição.Numa segunda série de estudos, pretendemos utilizar esta configuração ideal para demonstrar o padrão de transdução resultante da entrega in vivo de LV-MPs às vias aéreas de ratos, no pressuposto de que a entrega de LV-MPs no contexto do direcionamento das vias aéreas resultaria no aumento da eficiência de transdução do VE..
Todos os estudos em animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pela Universidade de Adelaide (M-2019-060 e M-2020-022) e pelo Comitê de Ética em Animais Síncrotron SPring-8.Os experimentos foram realizados de acordo com as recomendações da ARRIVE.
Todas as imagens de raios X foram obtidas na linha de luz BL20XU no síncrotron SPring-8 no Japão, usando uma configuração semelhante à descrita anteriormente .Resumidamente, a caixa experimental estava localizada a 245 m do anel de armazenamento do síncrotron.Uma distância amostra-detector de 0,6 m é usada para estudos de imagem de partículas e 0,3 m para estudos de imagem in vivo para criar efeitos de contraste de fase.Foi utilizado um feixe monocromático com energia de 25 keV.As imagens foram adquiridas utilizando um transdutor de raios X de alta resolução (SPring-8 BM3) acoplado a um detector sCMOS.O transdutor converte raios X em luz visível usando um cintilador de 10 µm de espessura (Gd3Al2Ga3O12), que é então direcionado para o sensor sCMOS usando uma objetiva de microscópio ×10 (NA 0,3).O detector sCMOS foi um Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japão) com um tamanho de matriz de 2.048 × 2.048 pixels e um tamanho de pixel bruto de 6,5 × 6,5 µm.Esta configuração fornece um tamanho de pixel isotrópico efetivo de 0,51 µm e um campo de visão de aproximadamente 1,1 mm × 1,1 mm.A duração da exposição de 100 ms foi escolhida para maximizar a relação sinal-ruído das partículas magnéticas dentro e fora das vias aéreas, minimizando os artefatos de movimento causados ​​pela respiração.Para estudos in vivo, um obturador rápido de raios X foi colocado no caminho dos raios X para limitar a dose de radiação, bloqueando o feixe de raios X entre as exposições.
A mídia LV não foi usada em nenhum estudo de imagem SPring-8 PB-PCXI porque a câmara de imagem BL20XU não possui certificação de Nível de Biossegurança 2.Em vez disso, selecionamos uma série de MPs bem caracterizados de dois fornecedores comerciais, cobrindo uma variedade de tamanhos, materiais, concentrações de ferro e aplicações - primeiro para entender como os campos magnéticos afetam o movimento dos MPs em capilares de vidro e, em seguida, em vias aéreas vivas.superfície.O tamanho do MP varia de 0,25 a 18 µm e é feito de diversos materiais (ver Tabela 1), mas a composição de cada amostra, incluindo o tamanho das partículas magnéticas no MP, é desconhecida.Com base em nossos extensos estudos de MCT 19, 20, 21, 23, 24, esperamos que MPs até 5 µm possam ser vistos na superfície das vias aéreas traqueais, por exemplo, subtraindo quadros consecutivos para ver melhor visibilidade do movimento do MP.Um único MP de 0,25 µm é menor que a resolução do dispositivo de imagem, mas espera-se que o PB-PCXI detecte seu contraste volumétrico e o movimento do líquido superficial no qual são depositados após serem depositados.
Amostras para cada MP na tabela.1 foi preparado em capilares de vidro de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EUA) com diâmetro interno de 0,63 mm.As partículas corpusculares estão disponíveis na água, enquanto as partículas CombiMag estão disponíveis no líquido proprietário do fabricante.Cada tubo é preenchido até a metade com líquido (aproximadamente 11 μl) e colocado no porta-amostras (ver Figura 1).Os capilares de vidro foram colocados horizontalmente na platina da câmara de imagem, respectivamente, e posicionados nas bordas do líquido.Um ímã de níquel com 19 mm de diâmetro (28 mm de comprimento) feito de terras raras, neodímio, ferro e boro (NdFeB) (N35, cat. No. LM1652, Jaycar Electronics, Austrália) com uma remanência de 1,17 T foi anexado a um tabela de transferência separada para conseguir alterar remotamente sua posição durante a renderização.A imagem de raios X começa quando o ímã é posicionado aproximadamente 30 mm acima da amostra e as imagens são adquiridas a 4 quadros por segundo.Durante a imagem, o ímã foi aproximado do tubo capilar de vidro (a uma distância de cerca de 1 mm) e depois movido ao longo do tubo para avaliar o efeito da intensidade e posição do campo.
Uma configuração de imagem in vitro contendo amostras de MP em capilares de vidro na fase de tradução da amostra xy.O caminho do feixe de raios X está marcado com uma linha pontilhada vermelha.
Uma vez estabelecida a visibilidade in vitro dos MPs, um subconjunto deles foi testado in vivo em ratos albinos Wistar fêmeas do tipo selvagem (~12 semanas de idade, ~200 g).Medetomidina 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japão), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japão) e butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Os ratos foram anestesiados com mistura Pharma (Japão) por injeção intraperitoneal.Após a anestesia, eles foram preparados para exames de imagem removendo o pelo ao redor da traqueia, inserindo um tubo endotraqueal (ET; cânula intravenosa de 16 Ga, Terumo BCT) e imobilizando-os em posição supina em uma placa de imagem personalizada contendo uma bolsa térmica para manter a temperatura corporal.22. A placa de imagem foi então fixada à plataforma de amostra na caixa de imagem em um leve ângulo para alinhar a traqueia horizontalmente na imagem de raios X, como mostrado na Figura 2a.
(a) Configuração de imagem in vivo na unidade de imagem SPring-8, caminho do feixe de raios X marcado com linha pontilhada vermelha.(b, c) A localização do ímã traqueal foi realizada remotamente usando duas câmeras IP montadas ortogonalmente.No lado esquerdo da imagem na tela, você pode ver a alça de arame segurando a cabeça e a cânula de administração instalada dentro do tubo ET.
Um sistema de bomba de seringa controlada remotamente (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) usando uma seringa de vidro de 100 µl foi conectado a um tubo PE10 (0,61 mm de diâmetro externo, 0,28 mm de diâmetro interno) usando uma agulha de 30 Ga.Marque o tubo para garantir que a ponta esteja na posição correta na traqueia ao inserir o tubo endotraqueal.Utilizando uma microbomba, o êmbolo da seringa foi removido e a ponta do tubo foi imersa na amostra de MP a ser entregue.O tubo de entrega carregado foi então inserido no tubo endotraqueal, colocando a ponta na parte mais forte do nosso campo magnético aplicado esperado.A aquisição de imagens foi controlada usando um detector de respiração conectado à nossa caixa de temporização baseada em Arduino, e todos os sinais (por exemplo, temperatura, respiração, abertura/fechamento do obturador e aquisição de imagens) foram registrados usando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Austrália) 22 Durante a geração de imagens Quando o invólucro não estava disponível, duas câmeras IP (Panasonic BB-SC382) foram posicionadas a aproximadamente 90° uma da outra e usadas para controlar a posição do ímã em relação à traqueia durante a geração de imagens (Figura 2b, c).Para minimizar artefatos de movimento, uma imagem por respiração foi adquirida durante o platô do fluxo respiratório terminal.
O ímã é fixado ao segundo estágio, que pode estar localizado remotamente na parte externa do corpo de imagem.Foram testadas diversas posições e configurações do ímã, incluindo: colocado em um ângulo de aproximadamente 30° acima da traqueia (as configurações são mostradas nas Figuras 2a e 3a);um ímã acima do animal e outro abaixo, com os pólos posicionados para atração (Figura 3b)., um ímã acima do animal e outro abaixo, com os pólos ajustados para repulsão (Figura 3c), e um ímã acima e perpendicular à traqueia (Figura 3d).Depois de configurar o animal e o ímã e carregar o MP em teste na bomba de seringa, administre uma dose de 50 μl a uma taxa de 4 μl/seg após a aquisição de imagens.O ímã é então movido para frente e para trás ao longo ou através da traqueia enquanto continua a adquirir imagens.
Configuração magnética para imagens in vivo (a) um ímã acima da traqueia em um ângulo de aproximadamente 30°, (b) dois ímãs configurados para atração, (c) dois ímãs configurados para repulsão, (d) um ímã acima e perpendicular ao traquéia.O observador olhou da boca para os pulmões através da traqueia e o feixe de raios X passou pelo lado esquerdo do rato e saiu pelo lado direito.O ímã é movido ao longo da via aérea ou para a esquerda e para a direita acima da traqueia na direção do feixe de raios X.
Também procuramos determinar a visibilidade e o comportamento das partículas nas vias aéreas na ausência de mistura de respiração e frequência cardíaca.Portanto, no final do período de imagem, os animais foram sacrificados humanamente devido à overdose de pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, EUA; ~65 mg/kg ip).Alguns animais foram deixados na plataforma de imagem e, após a cessação da respiração e dos batimentos cardíacos, o processo de imagem foi repetido, acrescentando-se uma dose adicional de MP caso nenhum MP fosse visível na superfície das vias aéreas.
As imagens resultantes foram corrigidas para campos planos e escuros e depois montadas em um filme (20 quadros por segundo; 15–25 × velocidade normal dependendo da frequência respiratória) usando um script personalizado escrito em MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Todos os estudos sobre a entrega do vetor do gene LV foram conduzidos no Centro de Pesquisa Animal de Laboratório da Universidade de Adelaide e tiveram como objetivo usar os resultados do experimento SPring-8 para avaliar se a entrega do LV-MP na presença de um campo magnético poderia melhorar a transferência genética in vivo .Para avaliar os efeitos do MF e do campo magnético, dois grupos de animais foram tratados: um grupo foi injetado com MF de VE com colocação de ímã, e o outro grupo foi injetado com um grupo controle com MF de VE sem ímã.
Os vetores do gene LV foram gerados utilizando métodos previamente descritos 25, 26 .O vetor LacZ expressa um gene de beta-galactosidase nuclear localizado impulsionado pelo promotor constitutivo do MPSV (LV-LacZ), que produz um produto de reação azul nas células transduzidas, visível em frentes e seções de tecido pulmonar.A titulação foi realizada em culturas celulares contando manualmente o número de células positivas para LacZ utilizando um hemocitômetro para calcular o título em TU/ml.Os transportadores são criopreservados a -80°C, descongelados antes do uso e ligados ao CombiMag misturando 1:1 e incubando em gelo por pelo menos 30 minutos antes da entrega.
Ratos Sprague Dawley normais (n = 3/grupo, ~2-3 anestesiados ip com uma mistura de 0,4mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Austrália) e 60mg/kg de cetamina (Ilium, Austrália) com 1 mês de idade) ip ) injeção e canulação oral não cirúrgica com cânula intravenosa de 16 Ga.Para garantir que o tecido das vias aéreas traqueais receba transdução do VE, ele foi condicionado usando nosso protocolo de perturbação mecânica descrito anteriormente, no qual a superfície das vias aéreas traqueais foi esfregada axialmente com uma cesta de arame (N-Circle, extrator de cálculos de nitinol sem ponta NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, EUA) 30 p28.Então, cerca de 10 minutos após a perturbação na cabine de biossegurança, foi realizada a administração traqueal de LV-MP.
O campo magnético utilizado neste experimento foi configurado de forma semelhante a um estudo de raios X in vivo, com os mesmos ímãs mantidos sobre a traqueia com pinças de destilação (Figura 4).Um volume de 50 μl (alíquotas de 2 x 25 μl) de LV-MP foi entregue à traqueia (n = 3 animais) usando uma pipeta com ponta de gel, como descrito anteriormente.O grupo controle (n = 3 animais) recebeu o mesmo LV-MP sem o uso de ímã.Após o término da infusão, a cânula é retirada do tubo endotraqueal e o animal é extubado.O ímã permanece no lugar por 10 minutos antes de ser removido.Os ratos receberam doses subcutâneas de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Austrália) seguido de retirada da anestesia por injeção intraperitoneal de 1 mg/kg de cloridrato de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Austrália).Os ratos foram mantidos aquecidos e observados até a recuperação completa da anestesia.
Dispositivo de entrega LV-MP em uma cabine de segurança biológica.Você pode ver que a manga Luer-lock cinza claro do tubo ET se projeta da boca e a ponta da pipeta de gel mostrada na figura é inserida através do tubo ET até a profundidade desejada na traqueia.
Uma semana após o procedimento de administração de LV-MP, os animais foram sacrificados humanamente por inalação de CO2 a 100% e a expressão de LacZ foi avaliada utilizando o nosso tratamento padrão X-gal.Os três anéis de cartilagem mais caudais foram removidos para garantir que qualquer dano mecânico ou retenção de líquidos devido à colocação do tubo endotraqueal não fosse incluído na análise.Cada traqueia foi cortada longitudinalmente para obter duas metades para análise e colocada em um copo contendo borracha de silicone (Sylgard, Dow Inc) usando uma agulha Minutien (Fine Science Tools) para visualizar a superfície luminal.A distribuição e o caráter das células transduzidas foram confirmados por fotografia frontal utilizando um microscópio Nikon (SMZ1500) com uma câmera DigiLite e software TCapture (Tucsen Photonics, China).As imagens foram adquiridas com ampliação de 20x (incluindo a configuração máxima para toda a largura da traqueia), com todo o comprimento da traqueia exibido passo a passo, proporcionando sobreposição suficiente entre cada imagem para permitir que as imagens fossem “costuradas”.As imagens de cada traqueia foram então combinadas em uma única imagem composta usando o Composite Image Editor versão 2.0.3 (Microsoft Research) usando o algoritmo de movimento planar. A área de expressão de LacZ nas imagens compostas traqueais de cada animal foi quantificada usando um script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) conforme descrito anteriormente28, usando configurações de 0,35 < Matiz < 0,58, Saturação > 0,15 e Valor < 0,7. A área de expressão de LacZ nas imagens compostas traqueais de cada animal foi quantificada usando um script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) conforme descrito anteriormente28, usando configurações de 0,35 < Matiz < 0,58, Saturação > 0,15 e Valor < 0,7. Use a opção LacZ no serviço de transferência de energia do local ideal para uso cenário automático de execução MATLAB (R2020a, MathWorks), como descrito em ранеее28, com configuração de 0,35 <оттенок, на <0,58, на сыщенность> 0,15 e valor <0 ,7. A área de expressão de LacZ em imagens traqueais compostas de cada animal foi quantificada usando um script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) conforme descrito anteriormente28 usando configurações de 0,350,15 e valor<0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 , 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a , Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化, 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 .................... QUADRIL Области экспрессии LacZ em составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использова não é um cenário automático MATLAB (R2020a, MathWorks), como descrito corretamente, com valor de uso 0,35 <оттенок <0,58, ь> 0,15 e valor <0,7 . As áreas de expressão de LacZ em imagens compostas da traqueia de cada animal foram quantificadas usando um script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) conforme descrito anteriormente usando configurações de 0,35 < matiz < 0,58, saturação > 0,15 e valor < 0,7.Ao rastrear os contornos do tecido no GIMP v2.10.24, uma máscara foi criada manualmente para cada imagem composta para identificar a área do tecido e evitar falsas detecções fora do tecido traqueal.As áreas coradas de todas as imagens compostas de cada animal foram somadas para dar a área corada total desse animal.A área pintada foi então dividida pela área total da máscara para obter uma área normalizada.
Cada traquéia foi embebida em parafina e seccionada com 5 µm de espessura.As seções foram contrastadas com vermelho neutro rápido por 5 minutos e as imagens foram adquiridas usando um microscópio Nikon Eclipse E400, câmera DS-Fi3 e software de captura de elemento NIS (versão 5.20.00).
Todas as análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).A significância estatística foi fixada em p ≤ 0,05.A normalidade foi testada utilizando o teste de Shapiro-Wilk e as diferenças na coloração LacZ foram avaliadas utilizando um teste t não pareado.
Os seis MPs descritos na Tabela 1 foram examinados por PCXI, e a visibilidade é descrita na Tabela 2. Dois MPs de poliestireno (MP1 e MP2; 18 µm e 0,25 µm, respectivamente) não foram visíveis por PCXI, mas as amostras restantes puderam ser identificadas (exemplos são mostrados na Figura 5).MP3 e MP4 são fracamente visíveis (10-15% Fe3O4; 0,25 µm e 0,9 µm, respectivamente).Embora o MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) contivesse algumas das menores partículas testadas, ele foi o mais pronunciado.O produto CombiMag MP6 é difícil de distinguir.Em todos os casos, nossa capacidade de detectar MFs foi bastante melhorada movendo o ímã para frente e para trás paralelamente ao capilar.À medida que os ímãs se afastavam do capilar, as partículas eram puxadas para fora em longas cadeias, mas à medida que os ímãs se aproximavam e a intensidade do campo magnético aumentava, as cadeias de partículas encurtavam à medida que as partículas migravam em direção à superfície superior do capilar (ver Vídeo Suplementar S1 : MP4), aumentando a densidade das partículas na superfície.Por outro lado, quando o ímã é removido do capilar, a intensidade do campo diminui e os MPs se reorganizam em longas cadeias que se estendem da superfície superior do capilar (ver Vídeo Suplementar S2: MP4).Depois que o ímã para de se mover, as partículas continuam a se mover por algum tempo após atingirem a posição de equilíbrio.À medida que o MP se aproxima e se afasta da superfície superior do capilar, as partículas magnéticas tendem a atrair detritos através do líquido.
A visibilidade do MP sob PCXI varia consideravelmente entre as amostras.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.Todas as imagens mostradas aqui foram tiradas com um ímã posicionado aproximadamente 10 mm diretamente acima do capilar.Os grandes círculos aparentes são bolhas de ar presas nos capilares, mostrando claramente as características das bordas em preto e branco da imagem de contraste de fase.A caixa vermelha indica a ampliação que aumenta o contraste.Observe que os diâmetros dos circuitos magnéticos em todas as figuras não estão em escala e são aproximadamente 100 vezes maiores do que os mostrados.
À medida que o ímã se move para a esquerda e para a direita ao longo do topo do capilar, o ângulo da corda MP muda para se alinhar com o ímã (veja a Figura 6), delineando assim as linhas do campo magnético.Para MP3-5, depois que a corda atinge o ângulo limite, as partículas se arrastam ao longo da superfície superior do capilar.Isso geralmente resulta no agrupamento de MPs em grupos maiores perto de onde o campo magnético é mais forte (ver Vídeo Suplementar S3: MP5).Isto também é especialmente evidente quando se obtém imagens perto da extremidade do capilar, o que faz com que o MP se agregue e se concentre na interface líquido-ar.As partículas no MP6, que eram mais difíceis de distinguir do que as do MP3-5, não se arrastaram quando o ímã se moveu ao longo do capilar, mas as cordas MP se dissociaram, deixando as partículas à vista (ver Vídeo Suplementar S4: MP6).Em alguns casos, quando o campo magnético aplicado foi reduzido movendo o ímã a uma longa distância do local de imagem, quaisquer MPs restantes desceram lentamente para a superfície inferior do tubo por gravidade, permanecendo na corda (ver Vídeo Suplementar S5: MP3) .
O ângulo da corda MP muda à medida que o ímã se move para a direita acima do capilar.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.A caixa vermelha indica a ampliação que aumenta o contraste.Observe que os vídeos adicionais são para fins informativos, pois revelam importantes estruturas de partículas e informações dinâmicas que não podem ser visualizadas nessas imagens estáticas.
Nossos testes mostraram que mover o ímã para frente e para trás lentamente ao longo da traqueia facilita a visualização do MF no contexto de movimentos complexos in vivo.Não foram realizados testes in vivo porque as esferas de poliestireno (MP1 e MP2) não eram visíveis no capilar.Cada um dos quatro MF restantes foi testado in vivo com o longo eixo do ímã posicionado sobre a traqueia em um ângulo de cerca de 30° com a vertical (ver Figuras 2b e 3a), pois isso resultou em cadeias de MF mais longas e foi mais eficaz do que um ímã..configuração encerrada.MP3, MP4 e MP6 não foram encontrados na traqueia de nenhum animal vivo.Ao visualizar o trato respiratório de ratos após matar humanamente os animais, as partículas permaneceram invisíveis mesmo quando volume adicional foi adicionado por meio de uma bomba de seringa.O MP5 apresentou o maior teor de óxido de ferro e foi a única partícula visível, por isso foi utilizado para avaliar e caracterizar o comportamento do MP in vivo.
A colocação do ímã sobre a traqueia durante a inserção do MF resultou na concentração de muitos, mas não todos, MFs no campo de visão.A entrada traqueal de partículas é melhor observada em animais sacrificados humanamente.Figura 7 e Vídeo Suplementar S6: MP5 mostra rápida captura magnética e alinhamento de partículas na superfície da traqueia ventral, indicando que os MPs podem ser direcionados para áreas desejadas da traqueia.Ao pesquisar mais distalmente ao longo da traqueia após a entrega de MF, alguns MFs foram encontrados mais próximos da carina, o que indica força de campo magnético insuficiente para coletar e reter todos os MFs, uma vez que foram entregues através da região de força máxima do campo magnético durante a administração de fluidos.processo.No entanto, as concentrações pós-natais de MP foram maiores em torno da área da imagem, sugerindo que muitos MPs permaneceram em regiões das vias aéreas onde a intensidade do campo magnético aplicado era maior.
Imagens de (a) antes e (b) depois da entrega de MP5 na traquéia de um rato recentemente sacrificado com um ímã colocado logo acima da área de imagem.A área representada está localizada entre dois anéis cartilaginosos.Há algum líquido nas vias aéreas antes da administração do MP.A caixa vermelha indica a ampliação que aumenta o contraste.Essas imagens foram retiradas do vídeo apresentado em S6: Vídeo Suplementar MP5.
Mover o ímã ao longo da traqueia in vivo resultou em uma mudança no ângulo da cadeia MP na superfície das vias aéreas, semelhante ao observado nos capilares (ver Figura 8 e Vídeo Suplementar S7: MP5).No entanto, em nosso estudo, os MPs não puderam ser arrastados ao longo da superfície das vias respiratórias vivas, como poderiam fazer os capilares.Em alguns casos, a cadeia MP aumenta à medida que o ímã se move para a esquerda e para a direita.Curiosamente, também descobrimos que a cadeia de partículas muda a profundidade da camada superficial do fluido quando o ímã é movido longitudinalmente ao longo da traqueia, e se expande quando o ímã é movido diretamente acima e a cadeia de partículas é girada para uma posição vertical (ver Vídeo Complementar S7).: MP5 às 0:09, canto inferior direito).O padrão de movimento característico mudou quando o ímã foi movido lateralmente através da parte superior da traqueia (ou seja, para a esquerda ou direita do animal, em vez de ao longo do comprimento da traqueia).As partículas ainda eram claramente visíveis durante o seu movimento, mas quando o ímã foi removido da traqueia, as pontas dos fios de partículas tornaram-se visíveis (ver Vídeo Suplementar S8: MP5, a partir de 0:08).Isto está de acordo com o comportamento observado do campo magnético sob a ação de um campo magnético aplicado em um capilar de vidro.
Imagens de amostra mostrando MP5 na traqueia de um rato vivo anestesiado.(a) O ímã é usado para adquirir imagens acima e à esquerda da traqueia, então (b) depois de mover o ímã para a direita.A caixa vermelha indica a ampliação que aumenta o contraste.Essas imagens são do vídeo apresentado no Vídeo Suplementar do S7: MP5.
Quando os dois pólos foram sintonizados em uma orientação norte-sul acima e abaixo da traqueia (ou seja, atraindo; Fig. 3b), as cordas MP pareciam mais longas e estavam localizadas na parede lateral da traqueia, e não na superfície dorsal da traqueia. traquéia (ver Apêndice).Vídeo S9:MP5).No entanto, concentrações elevadas de partículas num local (isto é, a superfície dorsal da traqueia) não foram detectadas após a administração de fluidos utilizando um dispositivo magnético duplo, o que normalmente ocorre com um dispositivo magnético único.Então, quando um ímã foi configurado para repelir pólos opostos (Figura 3c), o número de partículas visíveis no campo de visão não aumentou após o parto.Configurar as duas configurações de ímã é um desafio devido à alta intensidade do campo magnético que atrai ou empurra os ímãs, respectivamente.A configuração foi então alterada para um único ímã paralelo às vias aéreas, mas passando pelas vias aéreas em um ângulo de 90 graus, de modo que as linhas de força cruzassem a parede traqueal ortogonalmente (Figura 3d), uma orientação destinada a determinar a possibilidade de agregação de partículas em a parede lateral.ser observado.No entanto, nesta configuração, não houve movimento de acumulação de MF ou movimento magnético identificável.Com base em todos esses resultados, uma configuração com um único ímã e orientação de 30 graus foi escolhida para estudos in vivo de portadores de genes (Fig. 3a).
Quando o animal foi fotografado várias vezes imediatamente após ter sido sacrificado humanamente, a ausência de movimento interferente do tecido significou que linhas de partículas mais finas e mais curtas poderiam ser discernidas no campo intercartilaginoso claro, “balançando” de acordo com o movimento de translação do ímã.veja claramente a presença e o movimento das partículas MP6.
O título de LV-LacZ foi de 1,8 x 108 UI/mL, e após mistura 1:1 com CombiMag MP (MP6), os animais foram injetados com 50 µl de uma dose traqueal de 9 x 107 UI/ml de veículo LV (ou seja, 4,5 x 106 TU/rato).).).Nestes estudos, em vez de mover o ímã durante o trabalho de parto, fixamos o ímã em uma posição para determinar se a transdução do VE poderia (a) ser melhorada em comparação com a administração vetorial na ausência de um campo magnético, e (b) se a via aérea poderia esteja focado.As células sendo transduzidas nas áreas alvo magnéticas do trato respiratório superior.
A presença de ímãs e o uso de CombiMag em combinação com vetores de VE não pareceram afetar adversamente a saúde animal, assim como nosso protocolo padrão de entrega de vetores de VE.Imagens frontais da região traqueal submetida a perturbação mecânica (Figura 1 suplementar) mostraram que o grupo tratado com LV-MP apresentou níveis significativamente mais elevados de transdução na presença de um ímã (Fig. 9a).Apenas uma pequena quantidade de coloração azul LacZ estava presente no grupo controle (Figura 9b).A quantificação das regiões normalizadas coradas com X-Gal mostrou que a administração de LV-MP na presença de um campo magnético resultou numa melhoria de aproximadamente 6 vezes (Fig. 9c).
Exemplo de imagens compostas mostrando transdução traqueal com LV-MP (a) na presença de campo magnético e (b) na ausência de ímã.(c) Melhora estatisticamente significativa na área normalizada de transdução de LacZ na traqueia com uso de ímã (*p = 0,029, teste t, n = 3 por grupo, média ± erro padrão da média).
Seções neutras e rápidas coradas em vermelho (exemplo mostrado na Figura 2 suplementar) indicaram que as células coradas com LacZ estavam presentes na mesma amostra e no mesmo local relatado anteriormente.
O principal desafio na terapia genética das vias aéreas continua sendo a localização precisa das partículas transportadoras em áreas de interesse e a obtenção de um alto nível de eficiência de transdução no pulmão móvel na presença de fluxo de ar e eliminação ativa de muco.Para transportadores de VE destinados ao tratamento de doenças respiratórias na fibrose cística, aumentar o tempo de residência das partículas transportadoras nas vias aéreas condutoras tem sido até agora um objetivo inatingível.Conforme apontado por Castellani et al., o uso de campos magnéticos para melhorar a transdução tem vantagens sobre outros métodos de entrega de genes, como a eletroporação, porque pode combinar simplicidade, economia, entrega localizada, maior eficiência e menor tempo de incubação.e possivelmente uma dose menor de veículo10.No entanto, a deposição in vivo e o comportamento de partículas magnéticas nas vias aéreas sob a influência de forças magnéticas externas nunca foram descritos e, de facto, a capacidade deste método para aumentar os níveis de expressão genética em vias aéreas vivas intactas não foi demonstrada in vivo.
Nossos experimentos in vitro no síncrotron PCXI mostraram que todas as partículas que testamos, com exceção do poliestireno MP, eram visíveis na configuração de imagem que usamos.Na presença de um campo magnético, os campos magnéticos formam cordas, cujo comprimento está relacionado ao tipo de partículas e à força do campo magnético (ou seja, à proximidade e ao movimento do ímã).Conforme mostrado na Figura 10, as cordas que observamos são formadas à medida que cada partícula individual fica magnetizada e induz seu próprio campo magnético local.Esses campos separados fazem com que outras partículas semelhantes se acumulem e se conectem com movimentos de cordas de grupo devido a forças locais das forças locais de atração e repulsão de outras partículas.
Diagrama mostrando (a, b) cadeias de partículas formando-se dentro de capilares cheios de líquido e (c, d) uma traqueia cheia de ar.Observe que os capilares e a traqueia não estão desenhados em escala.O painel (a) também contém uma descrição do MF contendo partículas de Fe3O4 dispostas em cadeias.
Quando o ímã se moveu sobre o capilar, o ângulo do cordão de partículas atingiu o limite crítico para MP3-5 contendo Fe3O4, após o qual o cordão de partículas não permaneceu mais em sua posição original, mas se moveu ao longo da superfície para uma nova posição.magnético.Este efeito provavelmente ocorre porque a superfície do capilar de vidro é lisa o suficiente para permitir que esse movimento ocorra.Curiosamente, o MP6 (CombiMag) não se comportou dessa maneira, talvez porque as partículas eram menores, tinham um revestimento ou carga superficial diferente, ou o fluido transportador proprietário afetava sua capacidade de movimento.O contraste na imagem da partícula CombiMag também é mais fraco, sugerindo que o líquido e as partículas podem ter a mesma densidade e, portanto, não podem mover-se facilmente um em direção ao outro.As partículas também podem ficar presas se o ímã se mover muito rápido, indicando que a intensidade do campo magnético nem sempre pode superar o atrito entre as partículas no fluido, sugerindo que a intensidade do campo magnético e a distância entre o ímã e a área alvo não devem ser um fator importante. surpresa.importante.Esses resultados também indicam que, embora os ímãs possam capturar muitas micropartículas que fluem através da área alvo, é improvável que os ímãs possam mover partículas CombiMag ao longo da superfície da traqueia.Assim, concluímos que os estudos in vivo da MF do VE devem utilizar campos magnéticos estáticos para atingir fisicamente áreas específicas da árvore das vias aéreas.
Uma vez que as partículas são entregues ao corpo, elas são difíceis de identificar no contexto do complexo tecido em movimento do corpo, mas sua capacidade de detecção foi melhorada movendo o ímã horizontalmente sobre a traqueia para “mexer” as cordas MP.Embora a imagem em tempo real seja possível, é mais fácil discernir o movimento das partículas depois que o animal foi morto humanamente.As concentrações de MP eram geralmente mais altas neste local quando o ímã era posicionado sobre a área de imagem, embora algumas partículas fossem geralmente encontradas mais abaixo na traqueia.Ao contrário dos estudos in vitro, as partículas não podem ser arrastadas pela traqueia pelo movimento de um íman.Esta descoberta é consistente com a forma como o muco que cobre a superfície da traqueia normalmente processa as partículas inaladas, prendendo-as no muco e subsequentemente eliminando-as através do mecanismo de depuração muco-ciliar.
Nossa hipótese é que o uso de ímãs acima e abaixo da traqueia para atração (Fig. 3b) poderia resultar em um campo magnético mais uniforme, em vez de um campo magnético altamente concentrado em um ponto, resultando potencialmente em uma distribuição mais uniforme de partículas..No entanto, nosso estudo preliminar não encontrou evidências claras para apoiar esta hipótese.Da mesma forma, definir um par de ímãs para repelir (Fig. 3c) não resultou em mais sedimentação de partículas na área da imagem.Estas duas descobertas demonstram que a configuração de ímã duplo não melhora significativamente o controle local do apontamento do MP, e que as fortes forças magnéticas resultantes são difíceis de ajustar, tornando esta abordagem menos prática.Da mesma forma, orientar o ímã acima e através da traqueia (Figura 3d) também não aumentou o número de partículas restantes na área fotografada.Algumas destas configurações alternativas podem não ser bem-sucedidas, pois resultam numa redução na intensidade do campo magnético na zona de deposição.Assim, a configuração de ímã único a 30 graus (Fig. 3a) é considerada o método de teste in vivo mais simples e eficiente.
O estudo LV-MP mostrou que quando os vetores LV foram combinados com o CombiMag e administrados após serem fisicamente perturbados na presença de um campo magnético, os níveis de transdução aumentaram significativamente na traqueia em comparação com os controles.Com base em estudos de imagem síncrotron e resultados do LacZ, o campo magnético pareceu ser capaz de manter o VE na traqueia e reduzir o número de partículas vetoriais que penetraram imediatamente profundamente no pulmão.Essas melhorias de direcionamento podem levar a uma maior eficiência, ao mesmo tempo que reduzem os títulos entregues, a transdução não direcionada, os efeitos colaterais inflamatórios e imunológicos e os custos de transferência de genes.É importante ressaltar que, segundo o fabricante, o CombiMag pode ser usado em combinação com outros métodos de transferência de genes, incluindo outros vetores virais (como AAV) e ácidos nucléicos.